杜氏鹽藻葉綠體ATP合酶α亞單位基因啟動子的克隆及初步功能分析

谷輝輝, 馮書營, 潘衛(wèi)東, 李 杰, 薛樂勛

(1．鄭州大學(xué) 生物工程系, 河南 鄭州 450001; 2. 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院, 河南 洛陽 471003;3. 鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河南 鄭州450052)

杜氏鹽藻葉綠體ATP合酶α亞單位基因啟動子的克隆及初步功能分析

谷輝輝1, 馮書營2, 潘衛(wèi)東3, 李 杰1, 薛樂勛1

(1．鄭州大學(xué) 生物工程系, 河南 鄭州 450001; 2. 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院, 河南 洛陽 471003;3. 鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河南 鄭州450052)

采用DraⅠ,EcoR Ⅴ,PvuⅡ,ScaⅠ,SmaI和StuⅠ六種內(nèi)切酶消化杜氏鹽藻(Dunaliella salina)葉綠體基因組DNA, 與相應(yīng)DNA接頭連接, 構(gòu)建成無載體連接的鹽藻葉綠體GenomeWalker DNA文庫。利用長距離PCR(long distance-polymerase chain reaction, LD-PCR)技術(shù)從該文庫中克隆得到ATP合酶α亞單位(atpA)基因上游序列1 347bp。啟動子特征分析顯示該序列具有一般啟動子的保守序列特征, 根據(jù)這些特征設(shè)計引物, 擴增4個5′端系列缺失的啟動子片段, 并用綠色熒光蛋白基因作為報告基因, 構(gòu)建啟動子 5′端系列缺失重組質(zhì)粒, 以期鑒定不同啟動子片段的驅(qū)動報告基因轉(zhuǎn)錄的活性?；驑屴D(zhuǎn)化結(jié)果顯示, 啟動子長度約1 000 bp的重組載體轉(zhuǎn)化鹽藻后, 其轉(zhuǎn)化株中有黃綠色的鹽藻細胞出現(xiàn)。說明克隆的序列具有啟動子活性, 能驅(qū)動綠色熒光蛋白基因在杜氏鹽藻中有效表達, 為建立鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定了工作基礎(chǔ)。

杜氏鹽藻(Dunaliella salina); 葉綠體轉(zhuǎn)化; ATP合酶α亞單位基因啟動子

杜氏鹽藻(Dunaliella salina,以下簡稱鹽藻)是一種耐鹽性單細胞綠藻, 因其自身具有許多優(yōu)點,目前已被開發(fā)作為一種新型的生物反應(yīng)器, 以期生產(chǎn)多種藥用蛋白、抗體和人/獸用口服型疫苗等。目前, 已經(jīng)利用鹽藻的核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達了一些外源基因如gus、bar和gfp基因等[1], 但前期的研究發(fā)現(xiàn), 外源基因在細胞核轉(zhuǎn)化時容易發(fā)生基因沉默、表達量低等現(xiàn)象, 為此, 有研究者進行了轉(zhuǎn)化鹽藻葉綠體的嘗試[2]。葉綠體轉(zhuǎn)化與核轉(zhuǎn)化相比具有許多優(yōu)勢：其一, 外源基因更易通過同源重組機制定點整合到葉綠體基因組中, 有利于人為地控制外源基因的插入位點。其二, 葉綠體 DNA分子有多個拷貝, 達到同質(zhì)化后能保障外源基因在葉綠體中的高效表達。另外, 葉綠體基因組具備原核系統(tǒng)性質(zhì), 可以將多個外源基因采取“多順反子”的原核表達形式同時引入, 并受共同的啟動子控制, 既方便操作又可避免了“共沉默”現(xiàn)象的發(fā)生[3]。因此, 建立鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化體系具有十分重要的研究和應(yīng)用價值。

在建立鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化體系時, 需要構(gòu)建一個高效穩(wěn)定的葉綠體表達載體。而在表達載體構(gòu)建時,選擇一個高效的啟動子是至關(guān)重要的。就目前而言,在藻類葉綠體轉(zhuǎn)化研究中所用到的有 atpA、16S、psbA、psbD、rbcL和chlL啟動子等[4-7], 而編碼葉綠體ATP合酶a亞單位(atpA)基因的啟動子被認為是一個較強的啟動子[4,8]。但是, 目前有關(guān)鹽藻葉綠體啟動子方面的研究未見報道。為此, 本文力在克隆鹽藻的內(nèi)源性 atpA啟動子, 將其與外源基因連接構(gòu)建不同的重組表達載體, 通過基因槍轉(zhuǎn)化鹽藻后對其活性進行鑒定分析, 最終建立轉(zhuǎn)化鹽藻葉綠體表達體系, 為鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研發(fā)奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽藻(D. salina, UTEX-LB-1644)購自美國德州大學(xué)藻種中心。培養(yǎng)基為改良的Ben-Amotz 鹽藻培養(yǎng)基[9]; 培養(yǎng)條件： 溫度26℃, 光暗比12∶12, 光照強度4 500 lx。

載體和宿主菌： pMD-18T載體購自大連寶生物工程公司; PSP71-PCatpA -GFP質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建; 宿主菌JM109為作者所在的實驗室保存。

主要的試劑和儀器： 各種限制性內(nèi)切酶和工具酶購自大連寶生物(TaKaRa)公司, DNA回收、純化及質(zhì)粒提取試劑盒均購自杭州愛思進(Axygen)生物公司。熒光顯微鏡為Nikon ECLIPSE 50i; 基因槍及配套材料均購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體基因組的提取及葉綠體 Genome-Walker DNA文庫的構(gòu)建

取 500 mL對數(shù)生長期的鹽藻, 離心收集細胞,參照Arun Goyal法[10]進行葉綠體的分離純化。并采用 SDS-蛋白酶 K/酚/氯仿方案對葉綠體基因組進行提取[11]。采用DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,SmaI和StuⅠ6種平端酶酶切葉綠體基因組 DNA, 參照GenomeWalkerTMUniversal Kit User Manual的方法,與DNA接頭連接, 構(gòu)建成無載體連接的鹽藻葉綠體GenomeWalker DNA文庫。

1.2.2 鹽藻atpA基因啟動子序列的克隆

根據(jù)本實驗室前期已經(jīng)克隆的atpA基因編碼區(qū)的序列(GenBank number： AY435096), 設(shè)計用于擴增atpA 基因 5′上游序列的外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物 GSP1(5′CGTTCTAATCCATAAACACGAGCGATA3′)和 內(nèi)側(cè) 引 物 GSP2(5′ACGAGCGATACCGTCACCTACT TGGA3′)。以構(gòu)建的葉綠體 GenomeWalker DNA 文庫為模板, 以外側(cè)引物 GSP1和人工接頭外側(cè)引物AP1(GTAATACGACTCACTATAGGGC3′)進 行 第 一輪PCR。隨后, 取1 μL PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板, 用內(nèi)側(cè)引物 GSP2 和人工接頭內(nèi)側(cè)引物AP2(5'ACTATAGGGCACGCGTGGT3')進行第二輪PCR, 擴增得到atpA基因編碼區(qū)上游的全序列。PCR反應(yīng)參數(shù)參照 GenomeWalkerTMUniversal Kit User Manual說明。PCR結(jié)束后, 回收PCR產(chǎn)物, 克隆到pMD-18T載體上, 由北京博尚生物技術(shù)公司測序。

1.2.3 鹽藻atpA啟動子5′系列缺失片段的克隆

根據(jù)克隆得到的鹽藻葉綠體 atpA啟動子序列,分別設(shè)計四個上游引物： UP150EcoRⅤ： 5-GAGG GATATC TAGATAAGGGTATGAATGAC-3'; UP490EcoRⅤ： 5'-ATGTGATATC TGGAAGAGTGATAGGA GGTA-3'; UP840EcoRⅤ： 5'- GCCCGATATCAAAA TAAACTCATAAACCTA-3'; UP1280EcoRⅤ： 5'-CGCAGATATC ACTAAAGCCAATTCAAAGAC-3';引入EcoRV酶切位點(GATATC); 陰影部分為保護堿基。在下游設(shè)計一個接頭引物： DownNcoI： 5'-ACTA CCATGGACATCTTTACTTCTGGTGTAT-3', 引入NcoI酶切位點(CCATGG); 陰影部分為保護堿基, 保證讀碼框?qū)R。以含atpA啟動子全長序列的質(zhì)粒為模板, PCR擴增4個不同長度的啟動子序列, PCR反應(yīng)條件： 94℃ 30 s, 52℃ 40 s, 72℃ 90s。PCR 結(jié)束后, 對其產(chǎn)物進行EcoRV和NcoI雙酶切, 并純化回收四個PDatpA片斷。

1.2.4 重組表達載體的構(gòu)建

將載體PSP71-PCatpA-GFP用EcoRV和NcoI雙酶切, 采用DNA純化試劑盒對載體片段PSP71-GFP純化回收。在T4DNA連接酶的作用下, 分別和已純化回收的四個PDatpA片斷相連接。將連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌 JM109, 挑取陽性克隆進行質(zhì)粒的大量提取和酶切鑒定。將酶切鑒定正確的克隆進一步送測序公司測序。

1.2.5 基因槍法轉(zhuǎn)化鹽藻

取 1.5 mL處于對數(shù)生長后期的杜氏鹽藻細胞,4 000g離心3 min, 傾去上清, 用200～300 μL新鮮培養(yǎng)基重懸鹽藻, 之后均勻涂于平皿中的固體培養(yǎng)基上。按此方法制作四個平皿(每個平皿對應(yīng)一種重組載體), 靜置 15 min, 以備轟擊?；驑屪訌椫苽浼稗D(zhuǎn)化程序按照儀器說明書進行。轟擊后的平皿置于26 ℃, 300 lx的弱光照條件下過渡培養(yǎng)8～12 h ,然后分別用1 mL液體培養(yǎng)基將鹽藻洗至試管中, 在正常的培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)2～3 d, 置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 LD-PCR擴增atpA啟動子區(qū)

利用LA-Taq酶, 經(jīng)過巢式PCR擴增得到約1.5 kb的特異性片段(圖1)。該片段經(jīng)過測序顯示, 其全長為1 470 bp, 其中3'端序列(序列中陰影標(biāo)注部分)與已知序列是完全一致的, 5'端起始序列為引入的StuI酶切位點。結(jié)果說明, 成功克隆得到 atpA基因啟動子序列。

同時, 借助于 Softberry工具(http：//www. softberry.com/)對克隆得到的基因序列進行分析, 結(jié)果顯示該序列包含有四個具有啟動子特征的片段, 分別位于ATG上游的-150, -490, -840和-1280位置附近。其中, 位于-1 280位置的特征片段距翻譯起始密碼子較遠, 并在其下游存在一個比較保守的小 RNA基因, 推測其為atpA基因啟動子的可能性較小(圖2,圖3)。為此, 在下述實驗中, 利用其他三個特征性區(qū)域進行載體構(gòu)建工作。

2.2 分段擴增啟動子特征區(qū)域

通過設(shè)計的不同引物對atpA基因上游啟動子區(qū)進行PCR擴增, 結(jié)果如圖4所示, 通過四組PCR分別擴增得到約為250 bp、600 bp、800 bp和1000 bp特異性片段。

2.3 重組表達載體構(gòu)建

圖1 LD-PCR擴增結(jié)果Fig. 1 Amplification products of LD-PCR

圖2 鹽藻葉綠體atpA基因啟動子序列分析及啟動子5'系列缺失片段所用引物位置Fig.2 Sequence analysis of the atpA gene promoter and the positions of primers

通過對4個表達載體進行EcoRV和NcoI雙酶切鑒定, 分別得到了大小約250 bp、600 bp、800 bp和1 000 bp的啟動子區(qū)片段和3.5 kb的載體片段, 與預(yù)期的酶切結(jié)果相符(圖5), 測序結(jié)果也顯示擴增的四個特征性片段成功連接到 PSP71-GFP表達載體上。將酶切和測序鑒定正確的 4個重組表達載體分別命名為p250、p600、p800和p1000。

圖3 啟動子位置預(yù)測結(jié)果Fig. 3 Promoter prediction by softberry

圖4 PCR結(jié)果電泳圖Fig. 4 PCR products of 5′-deleted promoter fragments of the atpA gene

2.4 表達載體轉(zhuǎn)化鹽藻的GFP檢測

分別取50 μL轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)2～3 d的鹽藻滴片, 置于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示, 啟動子長度約1000 bp的重組載體 p1000轉(zhuǎn)化鹽藻后, 其轉(zhuǎn)化株中有黃綠色的鹽藻細胞出現(xiàn)(圖6)。這是因為鹽藻細胞葉綠體中含有大量的葉綠素, 在藍色熒光激發(fā)下呈紅色,而GFP的綠色熒光與紅色疊加之后便呈現(xiàn)黃綠色。結(jié)果表明, GFP在鹽藻葉綠體中得到了表達。其他3個重組載體轉(zhuǎn)化鹽藻后未見明顯的黃綠色細胞出現(xiàn)。

圖5 4種表達載體的雙酶切鑒定Fig. 5 The 4 recombinant vectors after digestions by EcoRV and NcoI

圖6 熒光顯微鏡下GFP轉(zhuǎn)化鹽藻結(jié)果(400×)Fig. 6 D. salina with transformed GFP observed by fluorescence microscopy (400×)

3 討論

鹽藻作為開發(fā)的一種新型生物反應(yīng)器, 越來越受到諸多分子生物學(xué)研究者和藻類研究人員的關(guān)注。在利用鹽藻反應(yīng)器進行外源性基因表達時, 鹽藻的葉綠體轉(zhuǎn)化是其較為重要的一個方面。在葉綠體轉(zhuǎn)化中, 構(gòu)建一個穩(wěn)定高效的表達載體是較為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。而啟動子作為一個調(diào)控基因表達的元件, 其對表達載體的構(gòu)建是至關(guān)重要的。目前, 在鹽藻轉(zhuǎn)化中常用的啟動子分為兩類, 即組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。在核轉(zhuǎn)化中為避免產(chǎn)物過量積累而對生物體造成傷害, 一般常用誘導(dǎo)型啟動子[12]。而在葉綠體系統(tǒng)對表達產(chǎn)物的積累有較強的承受能力,通常用強組成型啟動子。atpA基因啟動子屬于一個強組成型啟動子, 研究表明, 在萊因衣藻中 atpA基因簇(包括atpA, psbI, cemA和atpH 四個基因)共用一個啟動子, 這個強啟動子位于atpA基因的上游[4],它可以作為葉綠體載體表達系統(tǒng)的必要元件。本實驗室曾采用萊因衣藻葉綠體atpA基因啟動子作為鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的啟動子, 雖然也有轉(zhuǎn)錄起始活性, 但表達效率不高[2]。本研究克隆的鹽藻內(nèi)源性的atpA基因啟動子將對鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化具有重要意義。

基因組步行法特異性強, 是克隆已知序列側(cè)翼未知序列的較好方法, 常用來擴增未知啟動子以及其他調(diào)控序列。為此, 本研究利用該方法, 對 atpA基因上游啟動子區(qū)進行克隆, 并成功得到了1470 bp的序列。Softberry分析顯示, 得分最高的啟動子位置在ATG上游約840 bp的區(qū)域。該區(qū)域中, 所預(yù)測的-10 box和-35box之間的距離正好是17 bp, 符合強啟動子的特征[13]。而在用該工具分析萊茵衣藻葉綠體 atpA啟動子時也顯示得分最高的啟動子位置-10 box與-35box之間的距離也恰好是17 bp。這說明-840位置的這個啟動子區(qū)域極有可能就是活性最強的啟動子區(qū)。本研究通過 5'系列缺失的方法來鑒定不同長度的啟動子功能, 結(jié)果顯示, 僅有長度約為1000bp的啟動子片段能夠驅(qū)動綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達, 而其他三個啟動子片段不能有效驅(qū)動GFP基因的表達, 可能的原因為這三個片段分別缺失了不同的啟動子元件, 也提示 ATG上游 914～675之間的 239bp序列是啟動子活性所必需的, 包含著可能的關(guān)鍵調(diào)控元件, 這與上述預(yù)測的結(jié)果也一致。

綜上所述, 本研究成功克隆得到了鹽藻葉綠體atpA基因啟動子, 并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了四個轉(zhuǎn)化鹽藻葉綠休的重組表達載體, 用基因槍法對鹽藻進行轉(zhuǎn)化, 結(jié)果表明克隆得到的atpA基因上游序列具有啟動子活性, 為建立鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定了前期工作基礎(chǔ)。

致謝：本工作在河南省分子醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室完成, 特別表示感謝！

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Cloning and preliminary functional analysis of ATPase alpha subunit gene promoter fromDunaliella salina

GU Hui-hui1, FENG Shu-ying2, PAN Wei-dong3, LI Jie1, XUE Le-xun1
(1. Department of bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China; 2. College of Engineering and Medical Technology of Henan Science and Technology University, Luoyang 471003, China; 3. Medical College,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

Jul., 10, 2010

Dunaliella salina; chloroplast transformation; ATPase alpha subunit gene promoter

To clone and identify the function of the promoter of the ATPase alpha subunit (atpA) gene fromDunaliella salina, a chloroplast GenomeWalker DNA Library fromD. salinawas constructed, from which the 1 347 bp upstream fragment of atpA gene was cloned by long distance-polymerase chain reaction (LD-PCR).According to the positions of the different promoter elements predicted by bioinformatics tools, 5'-deleted series primers were designed to amplify different promoter fragments. Series 5'-deleted expression vector containing the GFP gene was constructed and then transformed to cells ofD. salinaby particle bombardment. The transformed cells with p1000 recombinant vector produced green fluorescence, but not in other transformation groups, suggesting that the cloned region had the activity of the promoter and may drive the effective expression of the GFP gene inD.salina. Our results have layed a foundation for the chloroplast transformation system ofD.salina.

Q244; Q782

A

1000-3096(2011)09-0018-06

2010-07-10;

2010-11-05

科技部國際科技合作項目(2007DFA01240); 國家自然科學(xué)基金項目(30700014)

谷輝輝(1982-), 男, 碩士, 主要從事藻類基因工程研究,E-mail： hhgu@zzu.edu.cn;薛樂勛,通信作者, E-mail： lxxue@public2.zz.ha.cn

張培新)