一株產(chǎn)低溫右旋糖苷酶海洋細(xì)菌的篩選和鑒定

呂明生, 王淑軍, 房耀維, 焦豫良, 劉 姝, 葛 亮, 吳彬彬, 李 佳

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2．江蘇省海洋資源開發(fā)研究院, 江蘇 連云港222001; 3. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306)

一株產(chǎn)低溫右旋糖苷酶海洋細(xì)菌的篩選和鑒定

呂明生1,2, 王淑軍1,2, 房耀維1,2, 焦豫良1,2, 劉 姝1,2, 葛 亮3, 吳彬彬1, 李 佳1

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2．江蘇省海洋資源開發(fā)研究院, 江蘇 連云港222001; 3. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306)

從連云港海域篩選得到一株產(chǎn)低溫右旋糖苷酶的菌株 LP621, 經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析和鑒定, 該菌株為Pseudoalteromonas tetraodonis。該菌產(chǎn)生低溫右旋糖苷酶的最適作用溫度為 30℃, 在 80℃保溫 2.5 h后該酶仍具有 40%以上的活性。目前尚無Pseudoalteromonas tetraodonis產(chǎn)生低溫右旋糖苷酶的報道。菌株 LP621產(chǎn)生的右旋糖苷酶作用溫度低, 耐熱性好, 有較大的潛在工業(yè)應(yīng)用價值。

低溫右旋糖苷酶; 交替假單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis); 篩選; 鑒定

右旋糖苷(Dextean)主要是 α-1,6-糖苷鍵連接的葡萄糖。右旋糖苷酶(Dextranase, α-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase, EC3.2.1.11), 又叫α-葡聚糖酶,是專一切割右旋糖苷中α-1,6糖苷鍵的水解酶[1]。右旋糖苷酶有很重要的應(yīng)用價值, 右旋糖苷酶在制糖工業(yè)中降解多糖聚合物, 降低多糖的相對分子質(zhì)量,從而降低糖的黏性[2]。而在口腔疾病研究的領(lǐng)域中,右旋糖苷酶能有效阻滯唾液糖蛋白和黏性葡聚糖所組成的口腔牙菌斑形成, 對齲齒和牙周病的防治具有重要的意義[3]。在血液替代品制造中該酶被用于控制右旋糖苷的水解; 并且可以增強(qiáng)抗菌藥物的療效[4]。

目前國內(nèi)外報道的產(chǎn)生右旋糖苷酶微生物主要為青霉(Penicilliumsp.)[5-9]、斯達(dá)油脂酵母(Lipomyces starkeyi)[10-11]、對角毛殼菌(Chaetomium gracile)[12]、曲霉(Aspergillus ustus)[13]、芽孢桿菌(Bacillussp.)[1]、鏈球菌(Streptococcussp.)[14-17]均能產(chǎn)生右旋糖苷酶。

根據(jù)Margsin 等1991年的定義, 通常把最適催化溫度在 30℃左右, 在 0℃左右仍有一定催化效率的酶稱為低溫酶。低溫酶具有最適溫度低, 低溫下催化活性高, 高溫下容易失活等性質(zhì), 在工業(yè)生產(chǎn)中可以節(jié)約能源及減少中溫菌的污染, 這些催化性質(zhì)使低溫酶在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有很大的優(yōu)勢[18]。目前右旋糖苷酶主要分離于人的口腔、陸地及溫泉的微生物, 大部分酶為中溫酶, 最適溫度大多為 50℃。低溫酶主要來源于低溫生態(tài)環(huán)境如海水、海底沉積物、冰川、高山、南北極的低溫微生物產(chǎn)生, 隨著陸地資源的不斷開發(fā)而面臨枯竭, 近年來人們逐漸將海洋微生物作為獲得低溫蛋白酶的新來源。目前國內(nèi)外對海洋微生物產(chǎn)右旋糖苷酶的研究尚未見報道。

在本研究中, 作者從連云港海域貝類中篩選到一株產(chǎn)生低溫右旋糖苷酶的海洋細(xì)菌, 初步研究表明酶的最適作用溫度為 30℃; 對該菌株的生理生化特征和分子鑒定進(jìn)行了研究, 鑒定為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)LP621。本研究為海洋細(xì)菌低溫右旋糖苷酶的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

連云港海州灣海域、港口及遠(yuǎn)洋捕撈船采集各類海魚、貝類、海水和海泥。

1.2 培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基： 蛋白胨 0.5%, 酵母粉 0.1%, 陳海水配制, pH 8.0。初篩培養(yǎng)基： 蛋白胨1%, 牛肉膏0.5%, 右旋糖苷 0.2%, 瓊脂 2%, 陳海水配制, pH 8.0。復(fù)篩培養(yǎng)基： 蛋白胨1%, 牛肉膏0.5%, 右旋糖苷0.2%, 陳海水配制, pH 8.0。產(chǎn)酶培養(yǎng)基： 酵母粉0.1%, 蛋白胨0.1%, 右旋糖苷 1%, 陳海水配制, pH 8.0。微量鹽溶液(g/L)： VOSO4·2H2O 0.005, LiCl 0.05,H3BO30.1, NiCl2·6H2O 0.01, BaCl2·2H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.01, ZnSO4·7H2O 0.1, CoCl2·6H2O 0.005, MnCl2·4H2O 0.2, Na2MoO4·2H2O 0.1, KBr 0.05,KI 0.05, NaF 0.05, Al2(SO4)30.05, H2WO40.005,SrCl2·6H2O 0.005。

1.3 菌株的篩選

海泥直接取1 g放入50 mL 2216E培養(yǎng)基中, 海魚、貝類將內(nèi)臟剪碎后放入無菌海水浸泡過夜, 過濾后取1 mL上清放入2216E培養(yǎng)基中, 20℃、180 r/min培養(yǎng)2～5 d。選取合適的培養(yǎng)液的稀釋液涂布初篩培養(yǎng)基, 20℃培養(yǎng)3～4 d, 用Simonson快速透明圈篩選法進(jìn)行篩選有透明圈的單菌落[19]。挑取有透明圈的單菌落菌株接入復(fù)篩培養(yǎng)基, 20℃、180 r/min培養(yǎng)2 d, 10 000 r/min離心15 min取上清液測定酶活力大小。選出透明圈大和酶活力高的菌株進(jìn)行下面試驗。

1.4 菌株生長特性

1.4.1 種子液培養(yǎng)

菌種接種到 2216E培養(yǎng)基中, 轉(zhuǎn)速 180 r/min,裝液量20%, 培養(yǎng)16 h。

1.4.2 溫度對菌體生長的影響

種子液2%接種于2216E培養(yǎng)基, pH 8.0, 轉(zhuǎn)速180 r/min, 裝液量20%, 在不同溫度(4～37℃)下培養(yǎng),于A600下測定在不同時間的細(xì)胞濃度, 同時將菌株放在0℃下培養(yǎng)觀察其生長狀況。

1.4.3 pH對菌株生長的影響

pH范圍5.0～11.0, 在最適溫度下培養(yǎng)36 h, 其余條件同1.4.2, 為了防止培養(yǎng)過程中pH的變化, 加入到2216E培養(yǎng)基至終濃度為10 mmol/L的緩沖液： pH5.0～6.0用MES緩沖液, pH7.0用PIPES緩沖液, pH8.0用HEPES緩沖液, pH 9.0～11.0直接用NaOH調(diào)[20]。

1.4.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株生長的影響

培養(yǎng)基用微量鹽溶液配制(不含 NaCl), NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0～14%, 在最適溫度和 pH培養(yǎng), 其余條件同 1.4.2。

1.5 菌株生理生化特性

按照 Bergey’s Manual of Systematic Baceriology(second edition)[21]的方法進(jìn)行各種生理生化反應(yīng)試驗。

1.6 16S rRNA基因序列分析

抽提細(xì)菌基因組DNA, 菌株 16S rRNA基因全長序列 PCR 擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。正向引物 P1：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物 P2：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′。PCR 產(chǎn)物純化后由上海生物工程公司測序。將所測得的16S rRNA基因序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行 Blast分析, 從GenBank中選擇近緣菌株的16S rRNA基因序列, 采用 Bioedit軟件程序進(jìn)行序列分析并用Neighbor- Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 以確定該菌株的分類地位。

1.7 菌株低溫右旋糖苷酶研究

1.7.1 酶液制備

將種子液以 2%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基,180 r/min, 25℃培養(yǎng)24 h, 10 000 r/min離心5 min, 沉淀即為菌體; 用pH 7.0的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液懸浮菌體, 冰水浴中經(jīng)超聲波破碎 5 min, 12 000 r/min離心 10 min, 取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。

1.7.2 酶作用溫度和熱穩(wěn)定性

將右旋糖苷酶粗酶液置于不同溫度下與底物右旋糖苷發(fā)生反應(yīng), 測定酶活力。取適量酶液分別在不同溫度下保溫2.5 h, 每隔0.5到1 h取出一組保溫處理的樣品, 迅速置于 4℃冰箱內(nèi), 待保溫結(jié)束后統(tǒng)一在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定殘余酶活, 以未處理酶液的酶活設(shè)為100%。

1.8 酶活力測定

將100 μL酶液加入到100 μL 1%的右旋糖苷磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH 7.0)中, 在30℃水浴反應(yīng)15 min, 用 3,5－二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖量[23]。酶活力單位定義： 在上述反應(yīng)條件下, 每分鐘催化產(chǎn)1 μg麥芽糖的酶量為一個活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過初篩得到 10株能夠產(chǎn)生水解透明圈的菌株, 選擇水解圈較大, 生長良好的5株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩, 分別測定24、48 h發(fā)酵液酶活力, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株 LP621產(chǎn)生的酶活力最高。菌株 LP621為革蘭氏陰性桿狀菌, (2.2～2.7)μm×(0.7～1.3)μm。在初篩平板上菌落形態(tài)為直徑4 ～7mm, 乳白色、濕潤、邊緣光滑、中間突起、菌落周圍有明顯的透明圈,見圖1。

圖1 菌株LP621在初篩平板上形成的透明圈Fig. 1 The clear zone on the screening plate formed by strain LP621

2.2 菌株的生長特性

2.2.1 溫度和時間對菌株生長的影響

菌株LP621在0℃能生長, 但生長緩慢, 菌株的最適生長溫度為 25℃, 生長溫度范圍為 4～37℃, 該菌株是適冷菌。如圖 2所示, 該菌株在 15℃時生長較為緩慢, 延滯期較長, 生物量較少; 隨著溫度的升高, 生長速率加快, 當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到 25℃后, 生物量最高, 但培養(yǎng)溫度高于 25℃延滯期逐漸變短, 生物量減少。菌株 LP621最適生長溫度為25℃, 10 h進(jìn)入對數(shù)期, 24 h進(jìn)入平衡期。

圖2 溫度對菌株LP621生長的影響Fig. 2 Effect of temperature on the growth of strain LP621

2.2.2 pH對菌株生長的影響

菌株LP621菌株生長pH為6.0～11.0, 在pH低于6時不生長, 最適pH為10.0(圖3)。

2.2.3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株生長的影響

菌株 LP621生長 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%～12%,不加 NaCl菌株不生長, 其最適生長 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 7%(圖 4)。

2.3 菌株LP621的生理生化反應(yīng)

圖3 pH對菌株LP621生長的影響Fig. 3 Effect of pH on the growth of strain LP621

圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株LP621生長的影響Fig. 4 NaCl concentration on the growth of strain LP621

表1 菌株LP621的生理生化特性Tab. 1 Physiological and biochemical properties of strain LP621

菌株 LP621無氯化鈉不能生長, 是嗜鹽菌, 能利用葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、纖維二糖、糖原、淀粉, 具體見表1。通過Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(second edition)分析比較, 初步鑒定該菌株為交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)的細(xì)菌。

2.4 16S rRNA基因分析

將菌株 LP621的 16S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號是 EU849123), 通過 16S rDNA序列同源性比較, 可以初步確認(rèn)該菌為交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。將親緣關(guān)系較近的菌株16S rDNA應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行多重比較, 用中鄰接法(Neibor-joining method)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 5),從進(jìn)化樹可以看出菌株LP621與Pseudoalteromonas tetraodonisDQ520896親緣關(guān)系最近, 且在一個分支中, 進(jìn)一步證明菌株 LP621屬于交替假單胞菌屬。交替假單胞菌(又稱假交替單胞菌)是新建立的一個海洋細(xì)菌屬,它獨特的生物學(xué)特性引起了越來越多研究者的關(guān)注, 目前在世界范圍海洋中, 包括南極洲嚴(yán)寒海洋環(huán)境中分離到多株交替假單胞菌, 已經(jīng)鑒定到種的有P. tunicata、P. agarolytic和P. bacteriolytica等30多種, 每年都有新種發(fā)現(xiàn)[24-25]。目前尚未見交替假單胞菌屬產(chǎn)低溫右旋糖苷酶的報道。

圖5 以16 S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 A phylogenetic relationship based on 16S rDNA

2.5 菌株 LP621右旋糖苷酶的作用溫度和熱穩(wěn)定性

目前交替假單胞菌產(chǎn)生低溫酶主要有脂肪酶、瓊脂糖酶、α-半乳糖酶、DNA連接酶、蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶等[25-31]。

菌株LP621產(chǎn)生的右旋糖苷酶的最適作用溫度為30℃, 0℃仍有45%的酶活力, 是低溫酶, 見圖6。酶的熱穩(wěn)定性較好, 如在50℃下保溫2.5 h后酶活仍能保持65%以上, 80℃保溫2 h后該酶依然有58%的活性, 2.5 h后該酶仍具有40%以上的活性, 見圖7。

據(jù)目前報道的右旋糖苷酶中, 酶的最適作用溫度多在50℃左右[1,5,8,13-14], 僅見Millson在2007年報道的斯達(dá)油脂酵母(Lipomyces starkeyi)重組右旋糖苷酶的最適作用溫度為30℃[11]。關(guān)于右旋糖苷酶熱穩(wěn)定性研究不多, 僅見程秀蘭[13]在1992報道的焦曲霉(Aspergillus ustus)產(chǎn)生的右旋糖苷酶在50℃保溫30分鐘酶活力損失55%[13]; 菌株LP621產(chǎn)生的右旋糖苷酶50℃下保溫2.5 h后酶活仍能保持65%以上。低溫酶與中溫酶相比有以下特點： (1)酶的最適反應(yīng)溫度較同功能的中溫酶低0℃～30℃; (2)在較低溫度下(＜40℃), 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(Kcat)或生理系數(shù)(Kcat /Km)高于來自中溫菌中的同類酶; (3)低溫酶的熱穩(wěn)定性差[32]。據(jù)文獻(xiàn)報道[31-34]大多右旋糖苷酶在高于50℃喪失大部分的酶活。因此菌株 LP621產(chǎn)生的右旋糖苷酶作用溫度低, 耐熱性較好, 具有較好的應(yīng)用前景。

圖6 酶作用溫度對酶活性的影響Fig. 6 Effect of temperature on the activity of dextranase

圖7 溫度對酶熱穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of temperature on the stability of dextranase

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Screen and identification of a marine psychrotrophic bacterium strain producing cold-adapted dextranase

Lü Ming-sheng1,2, WANG Shu-jun1,2, FANG Yao-wei1,2, JIAO Yu-liang1,2,LIU Shu1,2, GE Liang3, WU Bin-bin1, LI Jia1
(1. College of Marine Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;2. Jiangsu Marine Resource Development Research Institute, Lianyungang 222001, China; 3. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Nov., 5, 2010

cold-adapted dextranase;Pseudoalteromonas; Isolation; Identification

Strain LP621 producing cold-adapted dextranase was isolated from sea mud in Lianyungang seaside.Based on the 16S rDNA gene sequence and morphological, biochemical and physiological characteristics, the isolate was classified asPseudoalteromonas tetraodonis. Strain LP621 produced cold-adapted dextranase with an optimal temperature at 30℃. Forty percent of the dextranase remained active after incubation at 80℃ for 2.5 h. No work onPseudoalteromonas tetraodonisproducing cold-adapted dextranase has been reported so far. The dextranase showed high activity at low temperature and better thermostability, and may have a potential value to industrial application.

Q93-3

A

1000-3096(2011)05-0032-06

2010-11-05;

2011-01-22

國家863計劃項目(2011AA09070302); 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室開放課題項目(2008HS008); 連云港市自然科學(xué)基金項目(ZH200801)

呂明生(1963-), 男, 安徽旌德人, 副教授, 從事海洋生物技術(shù)研究, 電話： 0518-85895421, E-mail： mingshenglu@hotmail.com

梁德海)