N1，N5-二（1-甲基咪唑 -2-?；┒一返暮铣膳c表征

周成勇，張寶秀

（長治學院 化學系，山西 長治 046011）

N1，N5-二（1-甲基咪唑 -2-?；┒一返暮铣膳c表征

周成勇，張寶秀

（長治學院 化學系，山西 長治 046011）

文章首次報道了一種含咪唑環(huán)多胺類化合物N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-?；┒一返暮铣煞椒ǎ源嘶衔餅榛A，可以合成對稱平行的發(fā)卡式多酰胺分子，以期對DNA序列進行新的特異性識別，從而開發(fā)研制新型有效的工具酶或抗癌藥物。合成方法簡便易行、耗時短、不需要過柱分離，每一步合成都有較高的產(chǎn)率。

咪唑；二乙基三胺；多胺；化學核酸酶

1 引言

核酸斷裂與基因重組技術是分子生物學和基因工程的核心技術，其中DNA、RNA的定位斷裂又是該技術的關鍵。限制性內切酶能在特定位點切割DNA分子，但其識別位點僅為4～8個核苷酸，且只能在數(shù)目有限的位點斷裂DNA，給基因工程技術帶來一定限制。化學合成的DNA、RNA定位斷裂工具是國際上在二十世紀八十年代興起的一類新型非酶斷裂工具，稱為化學核酸酶（chemical nucleases）。它們既具有限制性內切酶的高度專一性，又能在人們預先設計的任何位點斷裂DNA和RNA，且制備簡便、價格便宜、不受酶的天然專一性限制，在新型抗腫瘤、抗愛滋病化學藥物的定向設計及其基因治療，基因工程研究中基因分離、大片段基因序列分析，染色體圖譜分析及DNA定位誘變，分子印記技術（footprinting），DNA的構象識別等方面均有重要意義和應用前景[1，2]。隨著遺傳工程及分子生物學技術的不斷發(fā)展，人們越來越不滿足于限制性內切酶的應用，化學合成的核酸斷裂工具越來越引起人們的重視。

化學核酸酶從結構上大致分為兩部分。一是DNA識別結合系統(tǒng)。在生物體內DNA序列的特異性識別常通過蛋白質與DNA的相互作用實現(xiàn)。但由于蛋白質分子具有量大、含量低、結構復雜且容易變性等特點，研究起來十分困難，因而尋找新的簡單有效的方法來特異性識別DNA序列，實現(xiàn)有目的的基因調控就具有十分重要的意義。目前用于識別DNA序列的非生物分子主要有寡聚核苷酸、寡聚核苷酸類似物——多肽核酸（PNA）[3]、多胺類化合物等。特別是多胺類化合物的研究，在美國加州理工大學Dervan教授的帶領下，近些年來取得了令人矚目的成果。迄今為止，科學家們成功地合成了一系列各種結構的、對DNA具有特異性識別功能的多胺分子?？s聚單體除N-甲基吡咯（Py）外，還有N-甲基咪唑（Im）、N-甲基-3-羥基吡咯（Hp）、噻唑、呋喃、苯環(huán)、嘧啶、嘌呤等[4-7]。結構形式有鏈狀、發(fā)卡式、環(huán)狀等[8-13]。不同結構的多酰胺分子可識別不同的堿基對，根據(jù)Dervan總結的規(guī)則：Py/Im對C·G堿基對（C：cytosine胞嘧啶，G:guanine鳥嘌呤）進行識別，Im/Py識別G·C堿基對，Py/Py識別 A·T和 T·A堿基對（A：ademine腺嘌呤，T:thymine胸腺嘧啶），Py/Hp識別A·T堿基對，Hp/Py識別T·A堿基對[9]。二是DNA的切割系統(tǒng)。DNA的切割從斷裂機理上可分為光切割、氧化切割和水解切割。（1）光切割是指切割試劑在光照下產(chǎn)生自由基使DNA發(fā)生斷裂。（2）氧化切割是指金屬配合物在雙氧水或分子氧存在的情況下，由還原劑活化導致核酸中戊糖環(huán)的斷裂，斷裂產(chǎn)物不能被重新克隆。（3）水解切割是指斷裂試劑使DNA骨架中的磷酸二酯鍵發(fā)生水解斷裂，并不破壞戊糖環(huán)，斷裂產(chǎn)物可被重新克隆。無論是氧化切割還是光切割，對DNA既無選擇性，斷裂產(chǎn)物也不能用連接酶進行連接，而且氧化切割還以破壞戊糖環(huán)為代價；而DNA的水解切割反應條件溫和，可在近生理條件下進行，且斷裂產(chǎn)物可用連接酶進行重新連接。因此發(fā)展高效、選擇性強、能有效水解斷裂核酸中磷酸二酯鍵的化學核酸酶具有非常之意義。

楊頻教授[14]等曾利用主族元素Mg為中心的雙核金屬配合物[Mg2（dien）Cl（OH）]Cl2·2H2O（dien：二乙基三胺）在近生理條件、不加任何其它外來物質的情況下，對PBR322DNA實現(xiàn)了有效切割。加入H2O2、還原劑（如DTT，抗壞血酸）及羥基自由基驅除劑（如DMSO，丙三醇）對反應基本無影響；無氧條件下仍可高效切割DNA。斷裂產(chǎn)物線形DNA可被T4連接酶有效連接。這都證明該斷裂是由于DNA磷酸骨架水解所致[14]。因此，本文選擇Im/Im作為DNA的識別系統(tǒng)；選擇二乙基三胺作為水解切割DNA的功能基，然后將其與DNA的識別系統(tǒng)進行連接，合成了一種對稱平行的多胺分子-N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-?；┒一罚云趯NA序列進行新的定位切割，從而研制新型有效的化學核酸梅和抗癌藥物。

2 實驗部分

2.1 主要實驗儀器和試劑

（1）熔點測定：數(shù)字式熔點儀（上海物理光學儀器廠）。

（2）1H NMR與13C NMR譜：DRX300MH超導核磁共振儀（瑞士BRUKER公司）；采用5mm核磁管，TMS為內標，化學位移以ppm表示，吸收峰的多重性以 s，d，t，q，b 分別表示單峰、雙峰、三重峰、多重峰和寬峰。

（3）IR譜：PERKIN-ELMER-983型傅立葉變換紅外儀（日本島津）；攝譜范圍4000-450 cm-1，分辨率4 cm-1，KBr壓片。吸收峰位置以cm-1為單位，強度以vs，s，m，w分別表示非常強、強、中強和弱。

（4）元素分析：VARI-EL型元素分析儀（德國EA元素分析系統(tǒng)公司），測定C、H、N。

（5）質譜測定：Themofinnigan Polaris質譜儀。

N-甲基咪唑購自于美國Sigma-Aldrich公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2.2 合成路線

合成路線如圖1所示。

圖1 化合物N 1，N 5-二（1-甲基咪唑-2-?；┒一返暮铣陕肪€Fig.1 Thesynthetic routeofthe compound N1，N5-bis（1-methylimidazole-2-carbonyl）diethylenetriamine.（i）DMF，100 ℃；（ii）anhydrousethylether；（iii）DMF，0℃.

2.3 實驗步驟

2.3.1 三氯乙酰氯的合成

三氯乙酰氯按照文獻[15]合成。將 300 g（1.8mol）三氯乙酸、10mlDMF和135ml（1.85 mol）二氯亞砜混合，加熱回流2小時。蒸餾除去二氯亞砜，收集116～117.5℃的餾分。得到321.9 g產(chǎn)品（淡黃色透明液體）。產(chǎn)率96.4%。b.p.116～117.5℃。

2.3.2 N-甲基-2-三氯乙?；溥虻暮铣?/h4>

在攪拌下將N-甲基咪唑（4.103 g，0.05 mol）的無水乙醚溶液在2小時內滴加入到三氯乙酰氯（9.09 g，0.05 mol）的無水乙醚溶液中，繼續(xù)攪拌2小時。將4 g碳酸鉀溶于15ml水中的溶液滴加到反應混合物中終止反應。分液后將醚層旋轉蒸發(fā)，得到10.52 g產(chǎn)品（淡黃色固體）。產(chǎn)率93.1%。m.p.95-96 ℃；1H NMR （CDCl3）：7.48（d，J=1.7 Hz，1H），6.98（d，J=1.7 Hz，1H），3.67（s，3H）。13CNMR（CDCl3）：187.6，153.8，135.7，123.5，94.0，29.8。

2.3.3 N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-?；┒一返暮铣?/h4>

將化合物N-甲基-2-三氯乙?；溥颍?.8035 g，7.93 mmol）溶于 50 mLDMF，冰水冷卻下攪拌20 min，將溶于10 mLDMF的二乙基三胺（0.4083 g，3.97 mmol）溶液滴加到上述溶液中，立即有黃色沉淀生成。冰水冷卻下繼續(xù)攪拌2 h，溫度升至室溫再攪拌2 h，停止反應。將反應混合液過濾，固體用THF、無水乙醚洗滌，真空干燥，所得固體再用熱THF重結晶，得黃色固體。m.p.152.4-153.2℃。Anal.Calc.for C14H21N7O2：C，52.65；N，30.70;H，6.63。Found:C，52.62；N，30.68；H，6.65。1H NMR（300MHz，DMSO-d6δ，ppm）：8.02（t，J=1.65Hz，2H，H6），7.64（d，J=5.76Hz，2H，H3），7.18（d，J=1.92Hz，2H，H4），3.65（s，6H，H1），3.12（t，J=6.32Hz，4H，H7），2.85（m，J=7.08Hz，4H，H8），2.09 （s，1H，H9）。13CNMR （300MHz，DMSO-d6，δ，ppm），C5 158.2，C2 154.8，C3 137.1，C4 124.4，C8 48.6，C7 39.6，C1 29.1。IR （KBr）: ν（N-H）3419.6，ν（N-H）3249.8，ν（Im C-H）3105.2，ν（C-H）2985.6，ν（C-H）2904.6，ν（C=O）1587.3，ν （N-H）1562.2，ν （C=C）1490.9，ν（N-CH3 N-C）1469.7，ν（C-N）1338.5，ν（C-N）1311.5，ν （C-N）1223.6，ν （C-N）1130.2，ν（C-C）1064.9，ν（C-C）1014.5，ν（C-H）972.1，ν（C-H）896.8，ν（C-H）867.9，ν（Im C-H）781.1。HRMS:calculated forC14H21N7O2319.18；found 319.16。

3 結果與討論

在合成過程中，考慮到二乙基三胺的結構對稱性，我們選擇了在其兩端連接咪唑環(huán)的方案，合成了一種對稱平行的多胺分子N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺。整個合成過程所采取的方法簡便易行，不需過柱分離，每步合成都有較高產(chǎn)率。在此化合物基礎上，還可繼續(xù)連接其它不同的DNA識別基團，從而可合成一系列DNA定位切割劑，對DNA的不同位點進行定位切割。

在制備1-甲基-2-三氯乙?；溥虻倪^程中，發(fā)現(xiàn)此固體在空氣中不穩(wěn)定，很容易吸水潮解。因此，得到的固體應在真空干燥器中放入干燥劑真空保存，或者得到該固體后立即進行下一步的反應。

正常N-甲基咪唑環(huán)上的H3和H4在H1-NMR譜中的化學位移應在7.00和6.88左右，但在目標化合物中咪唑環(huán)上連有吸電基團HN-CO-，通過共軛效應和誘導效應使得其質子周圍的電子云密度降低，對外加磁場的屏蔽效應減弱，所以其化學位移向低場移動，實際測得為7.64和7.18。而咪唑環(huán)上N-CH3上的質子（H1），由于與吸電基團HN-CO-相距較遠，則受其影響不大。

標題化合物與DNA的作用及其生物功能，尚待進一步研究。

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Synthesis and Characterization of N1,N5-Bis（1-methylim idazole-2-carbonyl）Diethylenetriam ine

ZHOU Cheng-Yong，ZHANG Bao-xiu
（Department of Chemistry，Changzhi University，Changzhi Shanxi 046011）

In this paper,the synthesis of a sort of symmetrical and parallel polyamide，N1，N5-Bis（1-methylimidazole-2-carbonyl）diethylenetriamine，was reported first.The whole process was also simple and convenientwithout column chromatography with high yields.The target compound was anticipated to recognize DNA sequence specifically and cleave itat predetermined site.

imidazole；diethylenetriamine；polyamide；chemical nuclease

O62

A

1673-2014（2011）02-0001-04

2010—10—18

山西省高?？萍奸_發(fā)項目資助課題（№：2007154）

周成勇（1963— ），男，河南省沁陽市人，博士，教授，主要從事有機合成和生物無機化學方面的研究。

（責任編輯 王璟琳）