Sigma B對單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受抗生素作用的影響

王莉，馮飛飛，張強(qiáng)，馮曉琴，尹曉蛟，羅勤

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實驗室，湖北武漢430079)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)，是人畜共患傳染病李斯特菌病(listeriosis)的主要病原菌［1］，能引起人和動物腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，是WHO公布的四大食源性致病菌之一［2］。臨床上主要用β-內(nèi)酰胺類(盤尼西林青霉素，氨芐青霉素)抗生素來治療患者［3］。近20年來抗生素在臨床上的濫用，使病原細(xì)菌的耐藥性已成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題，即使是一向被認(rèn)為對抗生素敏感的單增李斯特菌，也表現(xiàn)出對不同種類和不同作用機(jī)理的抗生素，如青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環(huán)素鹽酸和紅霉素等常用抗生素多重耐藥的趨勢［4］。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于該菌耐藥機(jī)制方面的研究較少，僅有的報道也集中于作用位點(diǎn)在單增李斯特菌細(xì)胞壁的抗生素，如盤尼西林青霉素和氨芐青霉素等作用的分子機(jī)理上［5］，而對其他抗生素的作用，迄今為止尚未見相關(guān)報道。Sigma B(σB)是許多革蘭陽性菌對環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)控因子［6］。已有文獻(xiàn)顯示σB在枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌中，對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性方面都具有重要的作用［7-8］，但在單增李斯特菌中σB是否也具有同樣功能，目前尚未見報道。本文通過比較單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株EGDe和其σB缺失株菌株EGDeΔsigB對盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環(huán)素鹽酸和紅霉素6種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)以及檢測這2種菌株在1×MIC、2×MIC和8×MIC的氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平3種抗生素中的生長活性，研究σB在單增李斯特菌耐受抗生素中的作用，以期為深入研究革蘭陽性食源性致病菌的致病機(jī)理、預(yù)防和治療細(xì)菌感染提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株EGDe為德國維爾茨堡大學(xué)微生物系Werner Goebel教授饋贈;EGDeΔsigB為本實驗室構(gòu)建保存。

1.1.2 試劑噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司):溶解于PBS(pH 7.2)配制成5 mg/mL溶液，過濾除菌，4℃避光保存;SDS促溶劑:1.0 g SDS(Sigma公司)溶于50 mL蒸餾水中(加熱溶解)以無水乙醇補(bǔ)充至250 mL;抗生素溶解于雙蒸水或者無水酒精中配制成母液，過濾除菌，－20℃保存;盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平，均為Sigma公司產(chǎn)品;硫酸慶大霉素、四環(huán)素鹽酸、紅霉素均為Amresco公司產(chǎn)品;BHI培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion)購自B＆D公司;二甲基亞砜為Promoter公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 EGDe和EGDeΔsigB MIC的測定參照藥品微生物學(xué)檢驗手冊［9］提供的方法進(jìn)行:挑取待測菌株的單個菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1∶100的比例將菌液轉(zhuǎn)入新鮮的BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待其OD600達(dá)到0.5時，將菌液加入到含有倍比稀釋的抗生素的培養(yǎng)基中，使其終濃度為105個/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 h。MIC的確定:以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為待測菌的MIC。

1.2.2 MTT比色法［10］檢測細(xì)菌的生長活性

MTT檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在一定的濃度范圍內(nèi)，甲瓚生成量與活細(xì)菌數(shù)目成線性相關(guān)，即甲瓚的濃度越高表示活細(xì)胞越多。甲瓚可用二甲亞砜及促溶劑溶解，并通過酶標(biāo)儀測定其光吸收值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。本實驗分別挑取EGDe和EGDeΔsigB的單個菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1∶100的比例將菌液轉(zhuǎn)入新鮮的BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待其OD600達(dá)到0.4時加入抗生素。以加入抗生素時記時為0，每隔固定時間，取菌液200 μL加40 μL MTT，37℃溫育30 min，5 000 r/min離心2 min，去上清，加100 μL二甲亞砜震蕩10 s后，加40 μL SDS促溶劑充分混勻，然后加1倍的95%乙醇混勻稀釋。測試液轉(zhuǎn)移到96孔板，每孔200 μL，酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)測定570 nm波長的吸光值，采用Origin 5.0統(tǒng)計軟件繪制細(xì)菌的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGDe和EGDeΔsigB對6種抗生素的MIC

如表1所示，EGDe對盤尼西林青霉素、四環(huán)素鹽酸和硫酸慶大霉素的MIC高于EGDeΔsigB，2種菌株的MIC依次分別0.16和0.08 μg/mL，0.25和0.125 μg/mL，以及0.5和0.125 μg/mL;而對氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平的MIC 2種菌株沒有差別，分別為0.19、0.125和0.032 μg/mL。為了進(jìn)一步研究σB在單增李斯特菌耐藥性中的作用，利用MTT法檢測比較了EGDe和EGDeΔsigB在后3種抗生素中的生長活性。

表1 EGDe和EGDeΔsigB對6種抗生素的MICTable 1 MICs of six antibiotics against EGDe and EGDeΔsigB

2.2 MTT法檢測EGDe和EGDeΔsigB在氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平3種抗生素中的生長活性

2.2.1 EGDe和EGDeΔsigB在氨芐西林青霉素中的生長活性如圖1所示，與未加抗生素的EGDe和EGDeΔsigB的生長相比，當(dāng)加入氨芐西林青霉素后，EGDe和EGDeΔsigB的生長立即出現(xiàn)遲滯現(xiàn)象，活細(xì)胞量減少，生長曲線呈下降趨勢;經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后，耐藥的細(xì)菌細(xì)胞恢復(fù)生長，曲線上升。EGDe和EGDeΔsigB遲滯程度以及解除遲滯、恢復(fù)生長所需的時間與加入的抗生素濃度均呈正相關(guān)。如1×MIC(0.19 μg/mL)的氨芐西林青霉素對EGDe的生長只有微弱的抑制作用，其生長曲線幾乎和未加抗生素時一致(圖1A);而2×MIC(0.38 μg/mL)的氨芐西林青霉素對EGDe的生長具有明顯的抑制作用(圖1B);當(dāng)加入8×MIC(1.52 μg/mL)的氨芐西林青霉素時，其遲滯程度達(dá)到最大(圖1C)。與EGDe相比，EGDeΔsigB對加入的抗生素的作用更為敏感，當(dāng)加入1×MIC(0.19 μg/mL)的氨芐西林青霉素時，其生長就出現(xiàn)較為明顯的遲滯，而且隨抗生素濃度升高，遲滯程度也比EGDe更為顯著，表明單增李斯特菌抵抗氨芐西林青霉素的抑制從而恢復(fù)生長的能力依賴于sigB基因。由此可見，sigB基因的編碼蛋白σB在單增李斯特菌耐受氨芐西林青霉素中具有重要作用。

圖1 MTT法比較EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的氨芐西林青霉素中的生長活性Fig.1 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of ampicillin，as well as untreated controls in the same diagram

2.2.2 EGDe和EGDeΔsigB在紅霉素中的生長活性圖2顯示的是EGDe和EGDeΔsigB在紅霉素中的生長曲線，其結(jié)果和這2種菌株在氨芐西林青霉素中的生長趨勢基本一致，即:當(dāng)加入紅霉素后，EGDe和EGDeΔsigB的生長立即出現(xiàn)遲滯現(xiàn)象，而且遲滯程度以及解除遲滯、恢復(fù)生長所需的時間與加入的抗生素的濃度均呈正相關(guān);同時，與EGDe相比，EGDeΔsigB對加入的抗生素的作用更為敏感，遲滯程度也比EGDe更為顯著。該結(jié)果表明單增李斯特菌抵抗紅霉素的抑制從而恢復(fù)生長的能力也依賴于sigB基因。σB在單增李斯特菌耐受紅霉素作用中具有重要作用。

圖2 MTT法比較EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的紅霉素中的生長活性Fig.2 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of erythromycin，as well as untreated controls in the same diagram

2.2.3 EGDe、EGDeΔsigB在利福平中的生長活性圖3顯示的是EGDe和EGDeΔsigB在利福平中的不同生長活性。與在氨芐西林青霉素(圖1)和紅霉素(圖2)中的生長曲線相比，盡管EGDe和EGDeΔsigB對利福平的作用均很敏感，1×MIC(0.032 μg/mL)的利福平就能顯著抑制2種菌株的生長活性(圖3A)，但同濃度的利福平作用下，EGDeΔsigB被抑制的程度比EGDe更深，解除遲滯時間、恢復(fù)生長所需的時間更長，顯示單增李斯特菌抵抗利福平的抑制從而恢復(fù)生長的能力依然依賴于sigB基因，表明σB在單增李斯特菌耐受利福平作用中具有重要作用。

圖3 MTT法比較EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的利福平中的生長活性Fig.3 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of rifampicin，as well as untreated controls in the same diagram

3 討論

近幾年的研究表明，食源性致病菌單增李斯特菌出現(xiàn)了耐藥性不斷增強(qiáng)的趨勢。自1988年首次報道了對四環(huán)素的1株耐藥株后，不斷從食品、環(huán)境、臨床等分離到多株耐受一或者多種抗生素的單增李斯特菌耐藥株［11-14］。而對于作為治療李斯特菌病的主要藥物—青霉素來說，其耐藥性更是明顯增強(qiáng):2001年，Walsh等［13］首次報道了單增李斯特菌對青霉素(Penicillin G and Ampicillin)的耐藥率為0.6%(2例/351例);到2009年，Davis等［15］檢測了90株單增李斯特菌對苯唑青霉素(oxacillin)、頭孢曲松(ceftriaxone)和氯林肯青霉素(clindamycin)的耐藥率分別為99%、72%和21%。因此有必要對單增李斯特菌耐藥機(jī)理進(jìn)行深入研究，為預(yù)防和治療細(xì)菌感染提供新的思路和理論依據(jù)。

Sigma B(σB)是許多革蘭陽性菌對環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)控因子。研究表明σB因子在細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性方面也具有重要的作用。將枯草芽胞桿菌sigB缺失突變株暴露在利福平中時，它的生長受到抑制，恢復(fù)生長的速度也沒有野生菌株快［7］。而對于金黃色葡萄球菌，σB更顯示出對多種抗生素產(chǎn)生抗性方面都具有重要的作用，如甲氧西林和萬古霉素［8，15］。本實驗通過檢測和比較單增李斯特菌野生菌株EGDe和其σB缺失突變菌株EGDeΔsigB對盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環(huán)素鹽酸和紅霉素6種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)，以及在氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平中的生長活性的差異，探索σB與單增李斯特菌耐受抗生素作用的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示:σB編碼基因sigB的缺失降低了突變株EGDeΔsigB對盤尼西林青霉素、硫酸慶大霉素和四環(huán)素鹽酸的MIC，以及在氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平中的生長活性，表明σB不僅僅參與耐受作用于單增李斯特菌細(xì)胞壁的抗生素，如盤尼西林青霉素和氨芐西林青霉素，同樣也參與調(diào)節(jié)作用于核糖體、RNA聚合酶、氨酰tRNA與核糖體的結(jié)合的抗生素的耐受應(yīng)答，如紅霉素、硫酸慶大霉素、利福平和四環(huán)素鹽酸。因此，σB在單增李斯特菌耐受多種抗生素作用中均起著重要的作用。那么，σB的具體作用機(jī)理是怎樣的呢?目前沒有相關(guān)報道，根據(jù)已有的實驗證據(jù)推測:σB可能參與調(diào)控細(xì)菌體內(nèi)與抗生素耐受性相關(guān)的基因的表達(dá)，從而直接或者間接作用于細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。例如:Guinane等［16］發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌細(xì)胞膜至少存在5種青霉素結(jié)合蛋白(PBP)，對這些蛋白進(jìn)行插入失活后，相應(yīng)突變株對盤尼西林青霉素(penicillin G)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢噻肟(cefotaxime)和頭孢呋辛(cefuroxime)4種β-內(nèi)酰胺類的抗生素的MIC均有不同程度的降低。而這些青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因如lmo0441，在Raengpradub等［17］的全基因組Microarry分析中被證明與σB調(diào)控相關(guān)。σB如何調(diào)節(jié)對其他抗生素的耐藥應(yīng)答，需要進(jìn)一步的研究。

另外，本實驗也表明在研究某個(些)基因在抗生素耐受性中的作用時，僅僅只檢測和比較標(biāo)準(zhǔn)株和突變株對抗生素的MIC，從而推斷目標(biāo)基因的功能的話，可能會失去一些重要的信息。例如，在本試驗中，EGDe和其σB缺失突變菌株EGDeΔsigB對氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平的MIC一樣，但是通過檢測2種菌株在這3種抗生素中的生長活性，發(fā)現(xiàn)EGDeΔsigB對加入的抗生素更敏感，恢復(fù)生長所需時間更長，表明σB在細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生應(yīng)答并獲得耐藥性，解除遲滯過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。

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