類環(huán)境激素鎘對隆線溞的急性生物毒性效應

李素貞,王 鵬

0 引言

“環(huán)境激素”(Environmental Hormone)是指在人類的生產(chǎn)和生活過程中產(chǎn)生,釋放到環(huán)境中并在環(huán)境中持久存在的一類化學物質,通過直接或間接的方式在動物和人類體內蓄積、富集,在機體內與激素受體結合,具有類似于人和動物內分泌激素的作用,引起人類等多種生物的神經(jīng)系統(tǒng)失調、內分泌紊亂、免疫能力下降和生殖失常,也稱為“環(huán)境荷爾蒙”。由于環(huán)境激素是由外部環(huán)境進入機體,并產(chǎn)生類似內激素的作用,干擾機體內分泌系統(tǒng),影響生物的生存和繁衍,又稱“外因性的分泌干擾物質”(Endocrine Disrupter或 Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs)[1-5]。已知和懷疑是環(huán)境激素的主要是人工合成的化學物質。目前,全球已經(jīng)合成的化學物質約 1 000萬種,每年新合成約10萬種化學物質[6]。其中,列入環(huán)境荷爾蒙的物質有 70種左右,除鎘、鉛、汞等幾種重金屬外,其他 60余種都是有機物質。鎘 (Cd)位于元素周期表第 5周期、第ⅡB族,價電子構型 4d105s2,在自然界中多以硫鎘礦存在并常與鋅、鉛、銅、錳等礦共存。石油燃燒和垃圾廢棄物的焚燒能造成鎘對大氣的污染,最終通過沉降污染水體和土壤;工礦排放的廢水是鎘污染水體的主要污染源。在一般人群中吸煙是重要的鎘污染源,據(jù)估計,每天吸 20支煙的人從煙草中吸入的鎘為 14～16μg[7]。對于動物和大多數(shù)不吸煙者來說,食物是鎘的主要來源。中國居民喜歡和常吃的豬肝、豬腎中鎘含量較高。中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所對全國家畜腎中鎘污染水平監(jiān)測研究發(fā)現(xiàn) 2003～2006年豬腎中鎘的含量大大超過了國家限量標準,檢出率為 96.85%,超標率為 30.96%[8]。

近年來,有專家學者就環(huán)境激素對生物的急性毒性做了研究,但是利用生殖周期短、繁殖速度快的隆線溞評價污染物的毒性以及對環(huán)境的影響,至今很少見報道。本文主要通過鎘對隆線溞的急性生物毒性(半致死濃度LC50)來討論鎘的環(huán)境激素效應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)本試驗采用的隆線溞 (daphnia carinata)為貴州大學資源與環(huán)境工程學院環(huán)境工程實驗室提供,采集于重慶三峽庫區(qū)的自然水體,經(jīng)多代孤雌生殖、純化的單克隆純生物株Dc42。

(2)氯化鎘 (CdCl2·2.5H2O)分析純,用萬分之一電子天平準確稱量,去離子水配制成有效離子(Cd2+)濃度為 1 000 mg/L的儲備母液,于 4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

參照中華人民共和國國家標準 GB/T 13266—91《水質 物質對蚤類 (大型蚤)急性毒性測定方法》[9]及《水和廢水監(jiān)測分析方法》[10],采用靜態(tài)毒理試驗。

(1)取 1 000 mg/L的氯化鎘母液,用標準稀釋水稀釋成濃度為 5、2、1、0.5、0.2、0.1、0 mg/L的溶液。

(2)取各濃度溶液于食用藥板上,在每個不同濃度的溶液中各加入 2只健康的隆線溞,觀察 24 h死亡個數(shù),從而找出最低全致死濃度和最大耐受濃度的范圍。

(3)根據(jù)找出的最低全致死濃度和最大耐受濃度,確定正式試驗溶液的濃度區(qū)間,然后按等對數(shù)間距設置 0.032、0.056、0.10、0.18、0.32、0.56、1.0、 1.8 mg/L 8個濃度組和 1個對照組 (人工稀釋水)。每個濃度組各做 5個平行、重復 2個批次,試驗持續(xù)時間 96 h。試驗期間除不喂食外,其他條件與常規(guī)培養(yǎng)相同。

(4)試驗開始后,前 8 h作連續(xù)觀察,然后在24、48、72、96 h時對試驗溞的存活情況進行記錄。隆線溞的死亡以“沉入水底,輕轉容器無任何反應”為死亡判斷標準[11,12],試驗過程中及時剔除死亡個體。

2 結果與分析

2.1 數(shù)據(jù)分析方法

死亡是被污染生物中毒的極端效應 (現(xiàn)象),死亡率通常被作為一個重要的生態(tài)毒理學指標用以評價污染物毒性的大小,以 LC50來確定污染物的致死劑量。本文用死亡率和LC50來綜合評價鎘對隆線溞急性生物毒性的大小。根據(jù)不同濃度的 Cd2+溶液中隆線溞的死亡總數(shù)及死亡時間 (表1),得到暴露在不同濃度的 Cd2+溶液的隆線溞的死亡率及死亡率趨勢(圖1);利用概率值法[11],求得 24、48、72、96 h的 LC50值;應用最大似然的逼近方法[11],對毒物濃度和受試隆線溞組群反應比例之間的關系,建立經(jīng)驗模型并對其參數(shù)進行擬合,得到相應的毒力回歸方程(表2)。

表1 Cd2+溶液中隆線溞的死亡個數(shù)統(tǒng)計

2.2 數(shù)據(jù)分析

圖1 不同濃度的 Cd2+溶液中 24、48、72、96 h降線溞的死亡率

由表1可以看出,同一時間段內隨著 Cd2+濃度的增加隆線溞的死亡數(shù)量增多,即隆線溞死亡率隨著Cd2+濃度的增大而升高,說明 Cd2+濃度越高毒性越強。

由圖1可知,在 24、48 h兩個時間段內,Cd2+濃度為 0～0.56 mg/L時,隆線溞的死亡率較小且死亡曲線重合;Cd2+濃度 >0.56 mg/L時死亡率急劇增大,Cd2+濃度增大至 1.8 mg/L時隆線溞死亡率達到100%(全部死亡);72 h時,Cd2+濃度 >0.32 mg/L時死亡率急劇增大,Cd2+濃度增大至 1.0 mg/L時隆線溞死亡率達到 100%;96 h時,當 Cd2+濃度 > 0.032 mg/L時隆線溞的死亡率逐漸增大,當 Cd2+濃度增大至 1.0 mg/L時隆線溞死亡率達到 100%。

表2 不同暴露時間Cd2+對隆線溞的半致死、致死濃度 mg/L

4條死亡率變化曲線說明了,隨著時間的延長隆線溞的死亡在不斷增加,可能是由于隨著隆線溞在含 Cd2+溶液暴露時間的延長,Cd2+在隆線溞體內逐漸積累,最終超過隆線溞個體耐受限度而致其死亡。當 Cd2+濃度為 0.056 mg/L時,4條死亡率變化的曲線均出現(xiàn)拐點,可能是同一物種的不同個體對環(huán)境有毒有害因素的反應不同,或同一個體在不同的生長發(fā)育期對環(huán)境污染的敏感性不同,從而造成個別隆線溞對暴露反應的差異性[13],而在本試驗中,溶液中 Cd2+濃度為 0.056 mg/L的 5個平行樣品中共 50只隆線溞,只有 1個死亡,由此導致的死亡率變化曲線出現(xiàn)拐點在誤差允許范圍之內。

由表2可知在試驗條件下,Cd2+對隆線溞的半致死濃度隨暴露時間的增加而迅速降低,24 h-LC50為 1.010 8 mg/L、48 h-LC50為0.794 6 mg/L,72 h-LC50為 0.499 3 mg/L,96 h-LC50為 0.200 3 mg/L,95%置信區(qū)間 0.169 4～0.233 7,安全濃度為 0.002 0 mg/L。此結果與楊靜(2006)研究中的 Cd2+對隆線溞LC50有一定的差異[14],這種差異與隆線溞生長狀況、生物毒性試驗的環(huán)境條件及試驗方法有關,致使試驗中隆線溞對同一毒物的敏感性也存在差異。

應用最大似然的逼近方法對毒物濃度和隆線溞組群反應比例之間的關系建立經(jīng)驗模型并對其參數(shù)進行擬合,對所得各時間段的毒力回歸方程進行卡方檢驗,表明所求毒力回歸曲線用來描述鎘對隆線溞的毒性作用是合適的。對隆線溞的急性生物毒性試驗表明 Cd2+有較強的生物毒性,對水生生物有很大的毒害作用。

為了考察試驗中同濃度的 5個平行兩兩之間差異的顯著性,采用Duncan’s新復極差法進行多重比較,應用單因素試驗統(tǒng)計分析 (表3、4)來推斷真實的處理效應是否存在。表中的 p值是傳統(tǒng)所說的α水平(顯著水平),通過 p值精確地反映 Cd2+對隆線溞急性毒性的結果的顯著水平。如果 0.01≤p< 0.05則結果顯著;如果 0.001≤p<0.01,則結果極顯著;p<0.001,則結果很高地顯著;p>0.05,則結果被認為沒有統(tǒng)計顯著性。

表3 Cd2+對隆線溞急性毒性試驗24、48 h單因素統(tǒng)計分析 mg/L

由表3知 Cd2+對隆線溞急性毒性試驗中 p值均為 0.000 1(p<0.001),都表現(xiàn)出很高的顯著水平。試驗進行 24 h時不同濃度 Cd2+對隆線溞急性毒性顯著的水平排序依次為:1.8>1.0>0.56= 0.32=0.18=0.10=0.056=0.032=0,即 Cd2+的濃度在 0～0.56mg/L范圍內處于同一顯著水平。48 h的急性毒性試驗結果顯著水平跟 24 h的相同。

表4 Cd2+對隆線溞急性毒性試驗72、96 h單因素統(tǒng)計分析 mg/L

由表4知 Cd2+對隆線溞急性毒性試驗中 p值均為 0.000 1(p<0.001),都表現(xiàn)出很高的顯著水平。由表4知試驗進行至 72 h時不同濃度 Cd2+對隆線溞急性毒性顯著的水平依次為:1.8=1.0> 0.56>0.32=0.18=0.10=0.056=0.032=0,Cd2+的濃度為 1.0 mg/L時呈現(xiàn)出的顯著性與 1.8 mg/L相同。96 h時不同濃度 Cd2+對隆線溞急性毒性顯著的水平排序依次為:1.8=1.0=0.56>0.32> 0.18>0.10=0.056>0.032=0,Cd2+的濃度為0.56 mg/L時呈現(xiàn)出的顯著性與 1.8 mg/L相同, 0.056 mg/L時的顯著水平與 1.0 mg/L相同。由此可知 p值精確地反映 Cd2+對隆線溞急性毒性作用的顯著水平隨著時間的延長而更加顯著,采用Duncan’s新復極差法進行多重比較更能真實地反映不同濃度的 Cd2+對隆線溞急性毒性效應的大小。

3 討論

(1)試驗結果表明,在同一時間段內,隆線溞的死亡率隨著Cd2+濃度的增大而升高,說明Cd2+濃度越高,對隆線溞急性毒性作用越強。

(2)Cd2+對隆線溞的 24、48、72、96 h的半致死濃度 (LC50)分別為 1.010 8、0.794 6、0.499 3、 0.200 3 mg/L,安全濃度為 0.002 0 mg/L。即隨隆線溞在 Cd2+溶液中的暴露時間的增加,半致死濃度呈下降趨勢,反映隆線溞對 Cd2+毒性的耐受程度隨時間的延長而降低。

據(jù)報道,鎘對鯽魚的 24、48、72、96 h的半致死濃度 (LC50)分別為 11.7、8.68、6.86、5.85 mg/L,安全濃度為 0.59 mg/L;鎘對羅非魚的 24、48、72、96 h的半致死濃度 (LC50)分別為 27.733 9、16.861 1、 12.425 3、9.118 1 mg/L,安全濃度為0.91 mg/L。(柏世軍.水環(huán)境鎘對羅非魚的毒性作用和機理探討[D].浙江大學.2006)因此,用隆線溞監(jiān)測環(huán)境激素對生物的急性毒性更具有預見性。

[1]Hutchinson T H,Matthiessen P.Endocrine disruption in wildlife:identification and ecological relevance[J].Science of the Total Environment,1999,233:1-3.

[2]Colbom T.Developmental effects of endocrine disrupting chemicals in wildlife and humans environment[J].Health Perspect,1993,101:378-384.

[3]Key SW.New study highlights hazards on hor mone disrupting chemicals[J].World Disease(weekly plus),1998,9: 11-12.

[4]Allen Y.The extent of estrogenic contaminants in the UK estuarine and marine environments further surveys of founder[J].Science of the Total Environment,1999,233:5-20.

[5]候祺棕,梁愛萍.環(huán)境激素的內分泌干擾機制及其對人體的影響[J].工業(yè)安全與環(huán)保,2005,31(4):7-9.

[6]崔麗英.環(huán)境激素污染與無公害蔬菜 [J].環(huán)境保護, 2001(7):43-44.

[7]朱志國,王桂賢,程靜華.用火焰原子吸收法測定十種香煙中鉀、鈣、錳、鉻和鎘 [J].光譜學與光譜分析 , 1999(2):210-211.

[8]蔣定國,王竹天,楊大進,等.2003～2006年全國家畜腎中鎘污染水平監(jiān)測研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2008, 20(2):114-116.

[9]國家環(huán)境保護總局,國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 13266-91水質 -物質對蚤類 (大型蚤)急性毒性測試方法[S].1992.

[10]國家環(huán)境保護總局水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京:中國環(huán)境科學出版社,2002:49-56.

[11]周永欣,章宗涉.水生生物毒性試驗方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1989:24-145.

[12]ISO 6341-1989Water quality-deter mination of the inhibition of the mobility ofDaphnia magna straus[S].1989.

[13]孟紫強.生態(tài)毒理學原理與方法[M].北京:科學出版社,2006:1-166.

[14]楊靜,袁玲,唐毅.利用隆線溞趨光行為檢測水體中五氯酚鈉和鎘的研究[J].環(huán)境科學學報,2006(6): 1011-1015.