張 楊,隋正紅,丁弘葉,仲 潔

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,山東青島266003)

龍須菜(Gracilaria leimaneiform is)屬紅藻門江蘺科江蘺屬,是一種可用于瓊膠提取的重要經(jīng)濟(jì)紅藻。UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是合成UDP葡萄糖(UDPGlc)的重要酶,它以U TP和葡萄糖-1-磷酸(Glc1p)為底物合成UDPGlc。UDPGlc在紅藻的碳代謝過程中扮演了重要的角色,它是半乳糖苷和紅藻糖苷合成的前體物質(zhì)[1-3]。半乳糖苷(或者稱為半乳糖聚物)是多數(shù)紅藻細(xì)胞壁也就是瓊脂和角叉菜膠最主要的組成成分[4-6]。紅藻糖苷是一種重要的光合產(chǎn)物,它的作用是作為短期的低分子量的碳水化合物的碳庫。UDPGlc在某些紅藻中還作為紅藻淀粉生物合成過程中次級葡萄糖基的供體[7-10],這一過程與真核生物中糖原的合成途徑類似[8,11-12]。

早在1960年代,UGPase便被分離出來,證明紅藻中存在該酶[13],但到目前為止,只有少數(shù)幾種紅藻UGPase基因的研究報道。在細(xì)翼枝藻Pterocladia capillacea中UGPase的活性曾被闡述[14],在江蘺Gracilaria gracilis中有蛋白和基因水平的研究[15];日本凋毛藻Grif fithsia japonica UGPase的基因僅有部分序列在NCB I數(shù)據(jù)庫中提交(GI:32401296)。迄今尚未見UGPase在龍須菜中的特征報道,也不清楚龍須菜中是否存在該反應(yīng)過程。

鑒于UGPase在紅藻碳儲存物質(zhì)尤其是在瓊膠代謝中的重要作用,作者克隆了龍須菜中UGPase的cDNA和基因組DNA序列,采用熒光實(shí)時定量PCR的方法檢測了不同瓊膠含量藻株UGPase基因的表達(dá)變化,揭示了龍須菜的瓊膠含量與UGPase基因表達(dá)的相關(guān)性,并推測在龍須菜中存在該酶催化的對應(yīng)反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗材料龍須菜采自青島湛山灣。將采集的新鮮藻體用滅菌水沖洗,去除藻體表面的泥沙,鹽分和雜藻。用吸水紙將表面水分吸除,鮮活藻體用于核酸的提取,干燥后藻體用于瓊膠的提取。

1.2 核酸的提取

龍須菜基因組DNA的提取使用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒。取鮮藻體100 mg經(jīng)液氮研磨至粉末狀,裝入700μL GP1緩沖液混勻后于65℃水浴45 min。等體積酚氯仿抽提離心后,吸取水相至新的離心管并加入700μL GP2,混合充分后轉(zhuǎn)入吸附柱離心、棄廢液。加入500μL GD緩沖液于吸附柱,離心去除蛋白,用700μL PW漂洗液漂洗2次,離心并晾干殘余漂洗液。最后滴加50μL洗脫液洗脫吸附柱上的DNA,收集DNA于-20℃儲存。

總RNA的提取使用OM EGA生物技術(shù)公司的Plant RNA Kit。取新鮮藻體尖部100 mg,液氮中研磨至粉末狀,加入到盛有500μL裂解液RB的離心管中,渦旋裂解1 min之后,依照試劑盒步驟提取總RNA。用TaKaRa公司的DNase I去除RNA中的DNA。將RNA于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 UGPase基因的克隆

1.3.1 UGPase基因部分序列的獲得 采用PCR的方法獲得UGPase基因的部分序列。引物序列參考文獻(xiàn)[15],且在引物列表中列出(見表1,引物A和B)。以基因組DNA為模板,擴(kuò)增獲得了330 bp的龍須菜UGPase基因片段。PCR擴(kuò)增在Thermo Electron公司的Thermal Cycler熱循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系25 μL中含有10μmol/L的正、反向引物各1μL,2.5 mmol/L的dN TP 2μL,5U的Taq DNA聚合酶和1μL基因組DNA。擴(kuò)增條件為:94℃5 min,1個循環(huán);94℃1 min;55℃1 min;72℃1 min,30個循環(huán);72℃5 min,1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

1.3.2 3’RACE 按照TaKaRa公司的3’-Full RACE試劑盒操作獲得UGPase基因3’端序列。根據(jù)已知的UGPase基因部分序列設(shè)計特異引物3’213(見表1),與試劑盒中的錨定引物3’Site A dap to r Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃3 min,1個循環(huán);94℃1 m in;60℃1 m in;72℃1 min,30個循環(huán);72℃5 min,1個循環(huán)。于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的分子量。

1.3.3 5’RACE 5’端序列的獲得使用Clontech的SMART RACE cDNA Amp lification試劑盒。設(shè)計特異的外側(cè)引物5’288和內(nèi)側(cè)引物5’214(見表1),分別與試劑盒中的錨定引物10×Universal Primer A M ix和Nested Universal Primer A進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。外側(cè)PCR反應(yīng)條件為94℃30 s;65℃30 s;72℃1 min,25個循環(huán);72℃3 min,1個循環(huán)。內(nèi)側(cè)巢式PCR反應(yīng)以外側(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物10倍稀釋后取1μL作為模板,于50μL體系中進(jìn)行,其中反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30,其它條件不變。

1.3.4 UGPase基因DNA序列的獲得 根據(jù)UGPase基因的已知序列設(shè)計引物Qus和Qua(見表1),以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為94℃5 m in,1個循環(huán);94℃1 m in;60℃1 min;72℃1 m in 30 s,30個循環(huán);72℃5 min,1個循環(huán)。于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 本研究中采用引物的特征Table 1 Characterization of primers employed in this study

1.3.5 回收和克隆 所有的PCR產(chǎn)物片段均通過瓊脂糖凝膠的PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行回收(OM EGA生物技術(shù)公司),將目標(biāo)片段連接到質(zhì)粒載體pMD18-T(TaKaRa公司)上,轉(zhuǎn)入細(xì)菌DH5α,經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選,挑取單菌落,分別以特異引物和通用引物M 13R/M 13F進(jìn)行PCR反應(yīng),檢測分子量,然后對克隆產(chǎn)物測序。

1.3.6 序列分析 基因序列特征通過網(wǎng)站軟件進(jìn)行分析(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE)。以Clustal W進(jìn)行多序列對位分析,用于與龍須菜UGPase氨基酸序列進(jìn)行比對的數(shù)據(jù)來自于NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.4 Southern blotting

Southern雜交實(shí)驗過程均依照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[16]。提取的DNA各5μg,用3種限制性內(nèi)切酶EcoRI,、Xba I和Bam H I進(jìn)行酶切消化后,于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。凝膠經(jīng)過變性和中和后,通過虹吸法將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,轉(zhuǎn)移時間為20 h。采用以引物A和B[15]擴(kuò)增所得的330 bp基因組序列,經(jīng)Roche公司的Dig High-Prime labeling and detection starter試劑盒制備和標(biāo)記探針。

1.5 瓊膠的提取

參照文獻(xiàn)[17]的方法略加改動。將收獲的每株鮮藻體分為3份,每份2 g左右,于60℃烘干至恒重,稱量記錄每份藻體干質(zhì)量。按照每0.1 g藻體干重添加4 m L NaOH(質(zhì)量濃度2.5%)的比例向每份樣品中添加NaOH溶液,放入恒溫水浴中(85℃)加熱堿處理2 h。用4層紗布過濾,蒸餾水洗滌藻體至p H=6.5左右,將水洗后的龍須菜放在錐形瓶中,按照每0.1 g藻體干質(zhì)量添加6 mL蒸餾水的比例向每份樣品中添加蒸餾水,溫度保持120～125℃于高壓鍋中煮2 h。降溫后用8層紗布過濾,過濾物在室溫凝固后-20℃冷凍過夜。冷凍物解凍后用蒸餾水沖洗,于60℃24 h烘干至恒重[18],稱量并記錄瓊膠干質(zhì)量。瓊膠含量=瓊膠干質(zhì)量/藻體干質(zhì)量(g/g)。

1.6 實(shí)時定量PCR檢測不同瓊膠含量組藻體中U GPase基因的表達(dá)量

1.6.1 不同瓊膠含量藻株的cDNA的合成 采用Promega公司的M-MLV Reverse Transcrip tase將龍須菜RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為:總RNA 1 μg,Oligo d T 0.5μg于70℃孵育5 min,冰上放置,在每個反應(yīng)管中加入5×M-MLV Buffer 5μL,Inhibito r 1μL,dN TPM ix(10 mmol/L each)1μL,M-MLV Reverse Transcrip tase 1μL,添加RNAase free water至總體積25μL,在42℃金屬浴中孵育60 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,70℃孵育10 min終止反應(yīng),-20℃儲存?zhèn)溆谩?.6.2實(shí)時定量PCR Real-time RT-PCR選用TOYOBO公司的SYBR green Real time PCR Master M ix,于AB I公司的7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。反應(yīng)體系為20μL,其中包含有10 μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master M ix,熒光定量PCR正、反向引物各1μL,反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 1μL,其余的用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序為兩步法:95℃60 s,1個循環(huán);95℃15 s;60℃60 s,40個循環(huán)。以每株藻體的cDNA為模板做3個平行樣,采集熒光信號。選擇在龍須菜中表達(dá)較為恒定的gap dh基因作為內(nèi)參,引物為gap dhs和gapdha[19],擴(kuò)增可得到163 bp的gapdh基因的部分序列。設(shè)計U GPase基因的引物Yus和Yua(見表1),擴(kuò)增可得到224 bp的UGPase基因部分序列。采用相對定量檢測的2-△△CT法來分析目的基因的表達(dá)情況[20]。其中△CT=CTU GPase-CTgapdh;△△CT=△CT目標(biāo)樣品-△CT校正樣品;2-△△CT=表達(dá)量的比值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

瓊膠含量和U GPase基因相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和t檢驗的方法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 U GPase基因的克隆和序列分析

克隆得到的龍須菜(Gracilaria leim aneiform is)UGPase基因的DNA與cDNA序列一致。cDNA序列長度為2 200 bp,其中包含1個由1 485 bp組成的完整的開放閱讀框(ORF),可翻譯成494個氨基酸殘基和終止密碼子UAG,3’U TR長度為385 bp,5’U TR長度為330 bp(GenBank Accession No.GU 586070)。

龍須菜UGPase基因的494個編碼氨基酸中,有59個酸性氨基酸,54個堿性氨基酸,168個疏水性氨基酸,138個極性氨基酸,編碼了54.727 kD的蛋白,其等電點(diǎn)為6.096。其中氨基酸的數(shù)量與G.gracilis的495個氨基酸相差不大,龍須菜UGPase基因的氨基酸序列與其它物種的UGPase的氨基酸序列相似性較高(見圖2)。其中與G.gracilis UGPase基因的相似性為91%,與G.japonica U GPase基因的相似性為74%,與其他物種的相似性為53%～57%。該酶含有5個賴氨酸殘基的保守位點(diǎn)(見圖2),這些殘基對于與底物結(jié)合以及催化反應(yīng)有著極其重要的作用[21-23]。以龍須菜序列為基準(zhǔn),其中K278,K344與磷酸鹽結(jié)合或者與α-D-glucose-1-phosphate結(jié)合有關(guān),K382與催化自身磷酸化作用有關(guān)[21]。氨基酸序列對比結(jié)果,在10個物種中都高度保守的氨基酸為“KLNGGLGT”和“KNSF”,在9個物種中都高度保守的氨基酸序列為“PPGHGD”和“DNLGA”,但還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于這些位點(diǎn)在紅藻中所行使功能的報道。

本文利用SMART技術(shù)得到了龍須菜UGPase的完整5’端cDNA序列,因為該技術(shù)利用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的5’-帽子結(jié)構(gòu)依賴型反轉(zhuǎn)錄酶,僅對具有完整5’-帽子結(jié)構(gòu)的m RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并在反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到m RNA 5’末端時,在反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端加上3個胞嘧啶核苷酸殘基(CCC),使SM ART Oligo GGG引物結(jié)合上去進(jìn)行第二鏈的延伸,通過模板轉(zhuǎn)換,為引物提供結(jié)合部位,保證了反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’末端的完整性[24]。獲得的5’U TR部分包含330 bp,該基因從起始密碼子A TG前330 bp處的堿基A開始轉(zhuǎn)錄。5’側(cè)翼序列的翻譯初始位點(diǎn)序列為GCTA TG,與多數(shù)紅藻的RCYA TG的翻譯起始特征一致[25]。3’U TR部分包含385 bp,在終止密碼子UAG之后261 bp處存在1個3’末端多聚A前的加尾信號:A TTA TT,與龍須菜半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的加尾信號相同[19],但不同于許多紅藻基因中比較保守的TAAA加尾信號。在江蘺G.gracilis中幾乎所有核基因的轉(zhuǎn)錄本的加尾信號都出現(xiàn)TAAA[25],它的U GPase基因3’非編碼區(qū)多聚A前加尾信號為AA TAAA[15]。表明龍須菜G.lemaneifo rmis部分基因與江蘺G.gracilis等紅藻的基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上可能存在不同。

許多紅藻中的核基因不含有內(nèi)含子,例如江蘺G.gracilis中的磷酸丙糖異構(gòu)酶[26]、龍須菜G.lem aneiform is的半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶[19]和角叉菜Chondrus crispus中的gapdh基因[27]。與江蘺G.gracilis的UGPase基因相同,龍須菜的UGPase基因內(nèi)也沒有內(nèi)含子。

圖1 UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.1 The amino acid sequences alignment of UDP-glucose pyrophospho rylase(UGPase)

2.2 Southern blotting分析

Southern實(shí)驗檢測了龍須菜基因組中UGPase基因的拷貝數(shù)(見圖3)。經(jīng)檢測UGPase基因是單一拷貝,表明在龍須菜中不存在UGPase的假基因,因此也排除了在后續(xù)的熒光定量分析中可能存在的假基因表達(dá)的干擾。

紅藻中大多數(shù)的功能基因都是單拷貝。在Galderia su lphuraria中發(fā)現(xiàn)UDP-葡萄糖尿苷基轉(zhuǎn)移酶基因是單一拷貝[28],龍須菜的UDP-葡萄糖尿苷基轉(zhuǎn)移酶基因是單一拷貝[19],江蘺G.gracilis中UGPase基因是單一拷貝[15]。在土豆中發(fā)現(xiàn)UGPase基因也是單一拷貝[29]。

圖2 UGPase基因的southern雜交結(jié)果Fig.2 Southern blo t hybridization of the UGPase gene

2.3 U GPase基因的表達(dá)與藻體瓊膠含量的相關(guān)性分析

為研究UGPase基因在瓊膠合成過程中的作用,文中測定了野生龍須菜的瓊膠含量,選取其中的14株,對其UGPase基因表達(dá)進(jìn)行了分析。根據(jù)不同藻株所提取的瓊膠含量的高低,將這14個藻株劃分為高瓊膠含量和低瓊膠含量兩組(見圖3),兩組材料的瓊膠含量差異顯著(P<0.01)。

以實(shí)時定量PCR檢測UGPase基因的相對表達(dá)(見圖3),研究發(fā)現(xiàn):UGPase基因的表達(dá)量在高瓊膠含量藻株中都高于低瓊膠含量藻株,高瓊膠組藻株平均的2-△△CT值約是低瓊膠組藻株的24倍。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明P<0.01,高瓊膠組與低瓊膠組的2-△△CT值間存在顯著差異,證明了UGPase基因表達(dá)與龍須菜瓊膠含量間存在顯著相關(guān)性。

圖3 不同藻株不同YIdeed in this study的瓊膠含量及其對應(yīng)的UGPase基因相對表達(dá)量。Fig.3 Agar contents of different algal strains and their exp ression levels of UGPase

UGPase基因在高瓊膠組藻株中的表達(dá)量高,在低瓊膠組藻株中的表達(dá)量低,說明UDP葡萄糖焦磷酸化酶是瓊膠合成途徑中的一種重要酶。然而,文中對龍須菜瓊膠合成過程的了解還很有限。最近報道,從龍須菜中獲得的與瓊膠代謝相關(guān)的另一個酶—GAL T(Galactose-1-phosphate uridylyltransferase),發(fā)現(xiàn)該酶基因的表達(dá)與藻體瓊膠含量有一定的相關(guān)性[19],涉及該途徑的其它成分及其調(diào)控特征則沒有報道,而瓊膠代謝是龍須菜碳代謝的重要部分,因此從理論上有必要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)研究。

另一方面,在同一海區(qū)中,藻體瓊膠含量的差異主要是藻體本身遺傳因素造成的?；虮磉_(dá)與瓊膠含量的相關(guān)性揭示了基因表達(dá)情況可作為檢測藻體瓊膠含量的指標(biāo)的潛力。龍須菜作為重要的產(chǎn)瓊膠海藻,其人工栽培在本世紀(jì)取得了長足的發(fā)展[30],先后在福建、廣東、山東、江蘇等省取得成功,栽培面積超過13 000 hm2,年產(chǎn)量達(dá)到萬t(干質(zhì)量),產(chǎn)值逾十億元,成為我國繼海帶和紫菜之后的第三大海藻栽培業(yè),并促進(jìn)了瓊膠制造業(yè)的發(fā)展。產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需要種質(zhì)選育作為后盾,對于龍須菜來說選育的首要性狀就是瓊膠含量,因此相關(guān)分子標(biāo)記或檢測技術(shù)的開發(fā)對產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。通過UGPase基因表達(dá)量與龍須菜瓊膠含量的研究,研究發(fā)現(xiàn)UGPase基因的表達(dá)量可以作為衡量瓊膠產(chǎn)量高低的一個指標(biāo),可對瓊膠產(chǎn)量起指示作用,有可能作為種質(zhì)篩選的分子標(biāo)記而應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化。

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