基于特異性基因的副溶血性弧菌快速分離鑒定

翁仕強(qiáng), 趙 勇, 潘迎捷, 盧 瑛

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

基于特異性基因的副溶血性弧菌快速分離鑒定

翁仕強(qiáng), 趙 勇, 潘迎捷, 盧 瑛

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋環(huán)境中常見的食源性致病菌。采用自行設(shè)計(jì)的改良初篩方案結(jié)合tlh、toxR這2種特異性基因的2次篩選開發(fā)了一種副溶血性弧菌的快速分離鑒定方法。應(yīng)用該法從海水、海泥及3種海產(chǎn)品中分離得到了19株副溶血性弧菌,再經(jīng)16S rDNA測(cè)序?qū)Ψ蛛x鑒定結(jié)果的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基于tlh、toxR這兩種特異性基因分離鑒定所得19株菌的準(zhǔn)確性為100%,全程檢測(cè)時(shí)間為3 d。上述結(jié)果顯示本研究開發(fā)的基于特異性基因的副溶血性弧菌分離鑒定法是一種高效、快速的檢測(cè)方法,特異性強(qiáng)且耗時(shí)短,在食源性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和大規(guī)模樣本的分析檢測(cè)領(lǐng)域具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

副溶血性弧菌;特異性基因;tlh;toxR;鑒定

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,簡(jiǎn)稱V.parahaemolyticus或V p)是一種革蘭氏陰性的嗜鹽微生物,屬于弧菌屬,是沿海地區(qū)常見的一種食源性致病菌,能夠引起人類腸胃炎[1],同時(shí)也能感染魚、蝦、蟹類以及甲殼類等多種水產(chǎn)動(dòng)物,對(duì)其養(yǎng)殖帶來不利[2-3]。它主要存在于海水環(huán)境中,如海產(chǎn)魚、蝦、貝類以及海水、海泥等。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地區(qū)頻繁發(fā)生,以沿海城市為主[4]。目前,副溶血性弧菌的傳統(tǒng)分離鑒定流程為:樣品先經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌,然后用副溶血性弧菌的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)分離純化出單菌落,最后經(jīng)一系列的生理生化鑒定來確定分離菌是否為副溶血性弧菌。因?yàn)榛【鷮俚亩喾N細(xì)菌在分類學(xué)上與副溶血性弧菌很相近,它們的生理生化鑒定結(jié)果很相像,因此傳統(tǒng)的分離鑒定方法有假陽(yáng)性反應(yīng),在可靠性方面有所欠缺,此外整個(gè)流程耗時(shí)長(zhǎng),一般需要5～7 d。

PCR方法應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境中的微生物有助于提高檢測(cè)的迅速性和準(zhǔn)確性。研究顯示,副溶血性弧菌中的tlh、toxR基因具有特異性保守片段[5-7],可用于設(shè)計(jì)PCR的特異性引物,其中tlh基因編碼副溶血性弧菌的不耐熱溶血毒素(TLH),所有的副溶血性弧菌都有該基因,因此tlh基因具有種特異性,目前國(guó)內(nèi)外研究者在開發(fā)副溶血性弧菌的PCR檢測(cè)技術(shù)時(shí)大都選用該基因。toxR基因最早是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn),后來研究人員發(fā)現(xiàn)toxR基因在副溶血性弧菌中也存在,主要起調(diào)控基因的功能[8]。本研究采用自行設(shè)計(jì)的改良初篩方案結(jié)合tlh、toxR這兩種特異性基因的2次篩選方法開發(fā)了一種副溶血性弧菌的快速分離鑒定方法,為今后副溶血性弧菌的大規(guī)模分離純化及高通量式快速分離鑒定方法的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株:副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A TCC 33846,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;樣品:海泥、海水、蟹和黃泥螺于2009年6月采自上海市臨港新城東海大橋附近灘涂,蛤蜊于2009年5月購(gòu)自上海新蘆苑集貿(mào)市場(chǎng);培養(yǎng)基及試劑:堿性蛋白胨水(APW)自行配制,硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂(TCBS)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB),三糖鐵(TSI)瓊脂購(gòu)自北京陸橋公司,TaqDNA聚合酶購(gòu)自TA KARA公司,D2000 DNA Ladder Marker購(gòu)自貝博公司;主要儀器:Stomacher 細(xì)菌分離器:德國(guó) Eppendorf公司產(chǎn)品,UVP EC3凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)UVP產(chǎn)品,Eppendorf A G PCR儀等:法國(guó) Intersecince產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 副溶血性弧菌的分離方法 各取海水25 m L、海泥25 g,分別加至225 m LAPW培養(yǎng)基中,混勻后放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng);食物樣品無(wú)菌操作各取25 g,分別放入均質(zhì)袋中,各加入225 m L APW培養(yǎng)基,然后放入均質(zhì)器(Stomacher 細(xì)菌分離器)中拍打2 min(拍打速度為6次/s)后,扎好袋口置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。次日取上述2種培養(yǎng)液于含3 g/dL NaCL的 TCBS平板上劃線分離,37℃過夜培養(yǎng)。挑取TCBS平板上的綠色或藍(lán)綠色可疑單菌落劃線于3 g/dL NaCl TSA平板上純化培養(yǎng)后做下一步鑒定。上述實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行。

1.2.2 副溶血性弧菌的鑒定 首先采用3 g/dL NaCl TSI試驗(yàn)進(jìn)行初篩,然后將TSI試驗(yàn)現(xiàn)象符合的可疑菌落采用PCR擴(kuò)增tlh與toxR基因以確定副溶血性弧菌,最后對(duì)含tlh、toxR2種基因的分離菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1)TSI試驗(yàn) 挑取3 g/dL NaCl TSA平板上的純培養(yǎng)菌落接種于3 g/dL NaCl TSI斜面(底部穿刺,斜面劃線),37℃培養(yǎng)過夜。底部變黃,斜面變紅,不產(chǎn)氣泡為副溶血性弧菌的試驗(yàn)現(xiàn)象。

2)菌株總DNA的提取 DNA提取采用熱裂解法,刮取一環(huán)3 g/dL NaCl TSI斜面上可疑菌落培養(yǎng)物接至100μL 3 g/dL生理鹽水中,懸浮后10 000 g離心10 min,除去上清。在沉淀中加入100 μL無(wú)菌NaOH(50 mmol/L),重懸后100℃加熱處理10 min。然后取50μL處理液,加入8μL Tris-HCl(1 mol/L,p H值為7.0)中和p H值后10 000 g離心10 min,取上清(即DNA模板)-20℃保存。

3)tlh、toxR基因的PCR擴(kuò)增及其特異性表征

PCR引物見表1,擴(kuò)增條件見表2。tlh、toxR2種基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性表征采用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合16S rDNA測(cè)序方式,測(cè)序結(jié)果首先在NCBI上進(jìn)行基因比對(duì),然后通過M EGA 4軟件構(gòu)建包括19株分離菌、9株弧菌以及2株非弧菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌分離鑒定結(jié)果

從TCBS選擇性培養(yǎng)基上挑取28株藍(lán)綠色菌落,所有菌落均先劃線于 TSA平板上純化培養(yǎng)后再做鑒定實(shí)驗(yàn)。

表1 tlh、toxR基因的擴(kuò)增引物Tab.1 Oligonucleotide primers of tlh gene and toxR gene

表2 tlh、toxR基因的PCR擴(kuò)增條件Tab.2 Amplification profiles of PCR

2.1.1 TSI試驗(yàn)結(jié)果 28株分離菌的 TSI試驗(yàn)顯示,有23株與對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)菌株一樣顯示底部變黃,斜面變紅,不產(chǎn)氣泡現(xiàn)象,因此我們選取了這23株疑似副溶血性弧菌進(jìn)行后續(xù)的PCR鑒定。

2.1.2tlh、toxR基因的 PCR擴(kuò)增結(jié)果 23株副溶血性弧菌疑似菌的tlh基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知,有19株分離菌在450 bp附近處擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致的基因片段,與預(yù)期的tlh基因片段大小吻合,說明這19株分離菌含有tlh基因。隨后我們選取這19株含tlh基因可疑菌株進(jìn)行了toxR基因的PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這19株分離菌在368 bp附近處均擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致的基因片段(見圖2),該片段大小與預(yù)期的toxR基因相吻合。

圖1 PCR擴(kuò)增分離菌株 tlh基因電泳圖譜Fig.1 PCR profiles of tlh gene of suspectable strains isolated from samples

圖2 PCR擴(kuò)增分離菌株toxR基因電泳圖譜Fig.2 PCR profiles of toxR gene of suspectable strains

2.1.3 16S rDNA測(cè)序驗(yàn)證 以含有tlh和toxR基因的19株菌為對(duì)象,擴(kuò)增了這19株分離菌的16S rDNA,然后送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序,再進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。測(cè)序結(jié)果顯示,這19株分離菌與副溶血性弧菌的序列相似度為99%～100%。以這19株分離菌和11株已知菌的16S rDNA序列比對(duì)并通過M EGA 4軟件分析建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3),系統(tǒng)發(fā)育樹顯示這19株分離菌與副溶血性弧菌的遺傳距離最近。上述結(jié)果顯示,這19株含有tlh和toxR基因的分離菌均為副溶血性弧菌。

3 結(jié) 語(yǔ)

目前,食源性致病菌的檢測(cè)正朝著快速、靈敏、特異性強(qiáng)、成本低的方向發(fā)展,目前在我國(guó)的食品工業(yè)領(lǐng)域,食源性致病菌的檢測(cè)以傳統(tǒng)的生理生化分離鑒定方法為主,一般需要7 d左右,耗時(shí)長(zhǎng),步驟多,給質(zhì)控和監(jiān)控部門帶來很大的不便性。Ying Bu Kim等[7]用373株已確定的副溶血性弧菌分別做理化鑒定和PCR鑒定,結(jié)果顯示理化結(jié)果有47株顯示為陰性,而PCR鑒定結(jié)果全為陽(yáng)性。由此可見,PCR分離鑒定方法準(zhǔn)確性較高。本研究采用國(guó)標(biāo)GB/T 4789.7-2008的增菌方法結(jié)合改良式初篩和PCR擴(kuò)增特異性基因的方法來分離鑒定海水環(huán)境中的副溶血性弧菌。首先,我們利用副溶血性弧菌的嗜鹽性設(shè)計(jì)了選擇性培養(yǎng)基(3 g/dL NaCl的TCBS)結(jié)合三糖鐵理化試驗(yàn)進(jìn)行可疑菌株的初篩,之所以在初篩中選擇三糖鐵試驗(yàn)是因?yàn)槲覀兘?jīng)過多次分菌篩選發(fā)現(xiàn)三糖鐵試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)副溶血性弧菌的篩選性能最好。初篩結(jié)束后,選取了副溶血性弧菌的tlh和toxR這2種特異性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增對(duì)可疑菌株進(jìn)行2次篩選,最后通過測(cè)序比對(duì)來驗(yàn)證基于這2種基因的2次篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示初篩時(shí)選取的可疑菌株其準(zhǔn)確率為82.6%。初篩后再經(jīng)副溶血性弧菌的tlh和toxR這2種特異性基因的2次篩選,測(cè)序比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)其準(zhǔn)確性為100%,說明本研究所選用的引物特異性強(qiáng),可靠性高。

圖3 M EGA4軟件構(gòu)建的19株分離菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the 19 isolated strains structure by MEGA4

副溶血性弧菌的特異性基因有:tlh基因、gyrB基因、Fla基因、toxR基因等。它們?cè)诟比苎曰【【芯幸欢ǖ谋Ｊ匦?。另?還有研究者設(shè)計(jì)耐熱直接溶血素基因(tdh)的特異性PCR引物,用于分離致病性副溶血性弧菌[10]。作者所在研究室過往在以tlh基因鑒定副溶血性弧菌時(shí)曾發(fā)現(xiàn)有2株分離菌 PCR檢測(cè)時(shí)為tlh陽(yáng)性,但經(jīng)16S rDNA測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)是哈維氏弧菌。故此,本研究在2次篩選時(shí)選用了tlh與tox R2種基因進(jìn)行PCR檢測(cè)以確保高準(zhǔn)確性,同時(shí)因?yàn)闇?zhǔn)確性有了雙重保險(xiǎn),建議實(shí)際應(yīng)用時(shí)可以省略測(cè)序過程以減低檢測(cè)成本。

綜上所述,相較于傳統(tǒng)的理化分離鑒定法,本研究開發(fā)的基于特異性基因的副溶血性弧菌快速分離鑒定法檢測(cè)特異性強(qiáng)且耗時(shí)短、成本低,整個(gè)過程包括分離、純化、鑒定,耗時(shí)3 d,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高,是一種快速簡(jiǎn)便且高效的方法(見圖4)。

圖4 傳統(tǒng)方法與本研究的PCR方法流程圖Fig.4 Flow chart of conventional isolation and PCR method in our study

若結(jié)合全自動(dòng)核酸提取儀,今后還可以在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)副溶血性弧菌的高通量檢測(cè)方法,在食源性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和大規(guī)模樣本的分析檢測(cè)領(lǐng)域具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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Rapid Isolation and Identification Method Based on Specific Gene for Vibrio parahaemolyticus

WENG Shi-qiang, ZHAO Yong, PAN Ying-jie, LU Ying
(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Vibrio Parahaemolyticusis a frequent food-borne pathogen in marine environments.A rapid isolation and identification method for Vibrio Parahaemolyticus was developed in this study by combining an imp roved screening method with a second screening based on specific genes(tlhandtox R).By using this method,19 strains ofVibrio parahaemolyticuswere isolated from marine water,ooze and threemarine products.Also,the 16S rDNA from the isolated strains was sequenced to validate the specificity.The results obtained by the specifictlh,toxRgene identification method were consistent with that from 16S rDNA sequencing,show n that the veracity of the identification method based on specific gene is 100%.Our results appeared that the isolation and identification method based on specific genes forVibrio parahaemoly ticusis an efficient and rapid method,which has high specificity and is timesaving,only need 3 days.It would be high potential application in the field of risk assessment of food-borne pathogens and of the large-scale detection researches.

Vibrio parahaemolyticus,specific gene,tlh,toxR,identification

＊

盧瑛(1971-),女,浙江東陽(yáng)人,理學(xué)博士,副教授,主要從事食品安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、納米生物技術(shù)等方面研究。Email:y-lu@shou.edu.cn

S 37

A

1673-1689(2011)03-0417-05

book=421,ebook=478

2010-05-22

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAD94B09);上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目(09YZ274);上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目;上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)。