維生素A對(duì)穩(wěn)定期COPD患者細(xì)胞因子表達(dá)的影響Δ

汪俊，余曉丹，劉曉，劉波，徐敏，楊敏麗，李可可，代織文，邵勇（.成都市第五人民醫(yī)院，成都市 630；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶市 40006）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種常見、多發(fā)、高致殘率和高致死率的慢性呼吸系統(tǒng)疾??；是以氣道的炎癥反應(yīng)為中心的疾病，且氣道炎癥反應(yīng)貫穿疾病的各個(gè)階段。COPD患者慢性炎癥的特征是中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞在氣道腔、氣道壁和肺實(shí)質(zhì)的聚集，這些炎癥細(xì)胞釋放不同的炎癥因子（如，腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8以及白三烯（LT）B4等）從循環(huán)系統(tǒng)中趨化炎癥細(xì)胞，放大炎癥效應(yīng)，誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)改變，與氧化應(yīng)激和蛋白酶/抗蛋白酶失衡等機(jī)制共同作用，促進(jìn)COPD的發(fā)生、發(fā)展[1]。穩(wěn)定期COPD患者誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞數(shù)以及IL-8、IL-6、IL-10與TNF-α均明顯高于正常對(duì)照[2]。上皮細(xì)胞是參與炎癥過程的效應(yīng)細(xì)胞，其可以促進(jìn)白細(xì)胞的特異性聚集，在中性粒細(xì)胞遷移、滯留和活化過程中起作用。維生素A（VA）對(duì)維持氣道上皮的完整性，預(yù)防氣道細(xì)菌感染有重要的作用，因此VA缺乏會(huì)影響COPD患者以中性粒細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)。既往對(duì)VA缺乏的幼兒研究及哮喘動(dòng)物模型均證實(shí)，補(bǔ)充VA能降低炎癥因子水平。從理論上推測(cè)，給予VA補(bǔ)充治療后可降低COPD患者氣道內(nèi)及系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。本研究基于上述理論，研究了COPD患者血清VA水平與誘導(dǎo)痰及血清中細(xì)胞因子（IL-8、TNF-α、IL-1β）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年12月－2010年6月成都市第五人民醫(yī)院呼吸科COPD數(shù)據(jù)庫中穩(wěn)定期COPD患者100例為研究對(duì)象，所有研究對(duì)象符合GOLD COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，中途退出及失訪者16例，共完成84例。其中，男性44例，女性40例，平均年齡67.8歲，輕度、中度、重度、極重度患者的比例為1∶1∶1∶1。所有患者隨機(jī)均分為對(duì)照組、治療1組和治療2組，3組患者的性別、年齡、病情程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

所有患者采用比利時(shí)麥迪肺功能測(cè)試儀測(cè)定入組時(shí)血清VA、血及誘導(dǎo)痰細(xì)胞因子（IL-8、IL-1β、TNF-α）水平。所有患者均給予常規(guī)治療。治療1組在此基礎(chǔ)上加服VA膠丸（青島雙鯨藥業(yè)有限公司，規(guī)格：5 000 u，批號(hào)：100114）5 000 u，qd；治療2組加服10 000 u VA（生產(chǎn)廠家，規(guī)格同治療一組），qd。于入組后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)再次進(jìn)行上述指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血清VA測(cè)定方法 采集靜脈血2 mL，避光保存，離心，取血清0.2 mL，加入0.2 mL乙醇沉淀蛋白后，用5 mL正己烷振蕩提取1 min，取正己烷層氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?.1 mL甲醇溶解，15 000 r·min－1離心，取上清液進(jìn)樣測(cè)定血清VA濃度。色譜條件：Agilent HP1100高效液相色譜儀，C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex，USA）；流速：1.0 mL·min－1；流動(dòng)相：純甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：25℃。

1.3.2 痰的誘導(dǎo)和制備[4]誘導(dǎo)前先用肺功能儀測(cè)定1 s用力呼氣容積（FEV1）和用力肺活量（FVC），重復(fù)3次，取最佳值。研究對(duì)象以清水漱口，首先預(yù)防性吸入沙丁胺醇?xì)忪F劑（葛蘭素史克制藥公司，規(guī)格：50 mg）200 μg，防止吸入高滲鹽水引起的氣道痙攣，然后超聲霧化吸入3%氯化鈉溶液[5]15 min后深咳痰液，此后每3 min深咳1次，共20～30 min。要求收集的痰液量至少＞1 mL。在吸入過程中密切觀察受檢者狀況，若在操作過程中出現(xiàn)哮喘癥狀或癥狀加重則暫停吸入。

將合格標(biāo)本（鏡檢見鱗狀上皮細(xì)胞占有核細(xì)胞比例＜20%，即為合格標(biāo)本）加入4倍于痰量的0.1%二硫蘇糖醇（DTT）37℃震蕩30 min，再加入4倍痰量的磷酸鹽緩沖液，通過60 μm的尼龍網(wǎng)過濾，2 000 r·min－1離心10 min，吸取上清液于－70℃冰柜保存。

1.3.3 血樣收集與處理 3組患者取空腹靜脈血3 mL各2管，其中一管中加有10%EDTA-Na2用于TNF-α的檢測(cè)，采血后立即1 500 r·min－1離心去除細(xì)胞，取1.0 mL血清，加入10 μL抑肽酶，搖勻，－70℃冰柜保存，待測(cè)；另一管中不加入抗凝劑和抑肽酶，采血后立即分離血清，－70℃冰柜保存，待測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞因子的檢測(cè)方法 IL-8、IL-1β、TNF-α水平測(cè)定均采用放射免疫分析，試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所，按說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組計(jì)量資料前、后比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)進(jìn)行方差分析，各組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后血清中VA水平的比較

治療前，3組VA水平均低于正常人，3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療1個(gè)月后，各組VA水平較治療前無明顯變化（P＞0.05）。治療3個(gè)月后，2個(gè)治療組VA水平分別較治療前顯著提高（P＜0.05），并且3組患者VA含量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2個(gè)治療組均高于對(duì)照組（P＜0.05），治療2組明顯高于治療1組（P＜0.05）。治療6個(gè)月后，2個(gè)治療組患者VA水平較治療3個(gè)月時(shí)明顯增加（P＜0.05），且3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療前、后血清中VA水平詳見表1。

表1 治療前后血清中VA水平（mg·mL－1，±s）Tab 1 Levels of vitamin A in serum before and after treatmen（tmg·mL－1，±s）

表1 治療前后血清中VA水平（mg·mL－1，±s）Tab 1 Levels of vitamin A in serum before and after treatmen（tmg·mL－1，±s）

組別對(duì)照組治療1組治療2組例數(shù)/n 28 28 28治療前0.34±0.10 0.31±0.09 0.30±0.12治療1個(gè)月后0.35±0.15 0.32±0.11 0.35±0.08治療3個(gè)月后0.32±0.11 0.41±0.15 0.48±0.17治療6個(gè)月后0.36±0.13 0.48±0.08 0.56±0.13

2.2 治療前后誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子的比較

治療前，3組誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子水平無顯著性差異（P＞0.05）。治療1個(gè)月后，各組誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子水平較治療前無明顯變化（P＞0.05）。治療3個(gè)月后，2個(gè)治療組細(xì)胞因子水平均較治療前有所下降（P＜0.05），但3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療6個(gè)月后，2個(gè)治療組細(xì)胞因子水平均較治療3個(gè)月時(shí)明顯下降，且3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2個(gè)治療組細(xì)胞因子水平均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），治療2組明顯低于治療1組（P＜0.05）。治療前、后誘導(dǎo)痰細(xì)胞因子水平詳見表2。

表2 治療前后誘導(dǎo)痰細(xì)胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 2 Cytokines levels of induced sputum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

表2 治療前后誘導(dǎo)痰細(xì)胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 2 Cytokines levels of induced sputum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

細(xì)胞因子IL-1β IL-8 TNF-α組別對(duì)照組治療1組治療2組對(duì)照組治療1組治療2組對(duì)照組治療1組治療2組治療前1.63±0.26 1.61±0.56 1.57±0.58 3.73±1.44 3.64±1.89 3.34±1.20 31.12±9.83 30.58±8.71 29.14±7.19治療1個(gè)月后1.59±0.31 1.57±0.61 1.55±0.34 3.69±1.23 3.71±1.75 3.56±1.08 26.23±9.03 18.32±7.56 16.29±8.51治療3個(gè)月后1.62±0.29 1.37±0.42 1.32±0.35 3.65±1.08 3.15±1.31 3.06±1.27 32.08±8.78 24.51±7.98 22.15±6.51治療6個(gè)月后1.67±0.35 1.22±0.28 1.09±0.21 3.57±1.74 2.36±1.39 2.08±1.32 33.45±9.32 20.95±8.41 16.51±6.87

2.3 治療前后血清中細(xì)胞因子的比較

治療前，3組血清中細(xì)胞因子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療1個(gè)月后，細(xì)胞因子水平較治療前無明顯提高，且3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療3個(gè)月后，2個(gè)治療組細(xì)胞因子水平均較治療前有所下降（P＜0.05），但3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療6個(gè)月后，2個(gè)治療組細(xì)胞因子水平均較治療3個(gè)月時(shí)明顯下降（P＜0.05），3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2個(gè)治療組均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），且治療2組明顯低于治療1組（P＜0.05）。治療前、后血清中細(xì)胞因子水平詳見表3。

表3 治療前后血清中細(xì)胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 3 Cytokines levels of serum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

表3 治療前后血清中細(xì)胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 3 Cytokines levels of serum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

細(xì)胞因子IL-1β IL-8 TNF-α組別對(duì)照組治療1組治療2組對(duì)照組治療1組治療2組對(duì)照組治療1組治療2組治療前0.33±0.15 0.32±0.13 0.35±0.09 0.64±0.20 0.62±0.18 0.59±0.17 26.21±10.0 25.02±9.27 27.00±10.84治療1個(gè)月后0.31±0.12 0.35±0.17 0.37±0.11 0.67±0.17 0.64±0.13 0.61±0.15 25.74±9.57 24.87±8.69 26.32±9.10治療3個(gè)月后0.35±0.15 0.28±0.11 0.26±0.08 0.64±0.18 0.52±0.18 0.49±0.11 26.23±9.03 18.32±7.56 16.29±8.51治療6個(gè)月后0.37±0.11 0.22±0.09 0.16±0.11 0.60±0.23 0.46±0.13 0.39±0.07 25.49±8.71 15.29±7.91 12.57±6.95

3 討論

COPD是由有毒顆粒和氣體（主要是吸煙）引起的肺部炎癥及全身效應(yīng)性疾病，不完全可逆的進(jìn)行性的氣流受限是其主要特征。其病理組織學(xué)特點(diǎn)是氣道上皮細(xì)胞、上皮下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、平滑肌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞黏液腺等，因慢性炎癥而發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞與修復(fù)，產(chǎn)生氣道管壁增厚變形，以平滑肌增厚最顯著，導(dǎo)致氣道管腔狹窄和氣道阻力增加，形成氣道重塑。產(chǎn)生這一系列病理生理改變的主要環(huán)節(jié)之一是慢性氣道炎癥[6]。

VA在維持機(jī)體正常功能、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和維持生理功能等方面發(fā)揮著重要作用，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、消除炎癥、調(diào)節(jié)免疫、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能，在呼吸系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。從動(dòng)物模型到人體試驗(yàn)均證實(shí)[7]，VA能促使肺泡上皮的修復(fù)。VA水平低下可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生以下影響：（1）呼吸道黏膜中纖毛柱狀上皮細(xì)胞消失，并出現(xiàn)鱗狀上皮化生、表層角化、脫落阻塞管腔，且腺體失去正常功能、分泌物減少、肺彈性減低、局部非特異性免疫功能降低，病毒或細(xì)菌易侵入人體內(nèi)引起繼發(fā)感染；（2）影響呼吸道黏膜，使其分泌型免疫球蛋白（SI-gA）分泌減少，從而影響局部免疫功能；（3）可導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能受損，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換受到明顯影響；（4）可使類固醇激素合成發(fā)生障礙及淋巴細(xì)胞抑制，降低抗過敏、抗感染的能力[8]。VA對(duì)維持氣道上皮的完整性，預(yù)防氣道細(xì)菌感染有重要的作用，而COPD患者的氣道上皮細(xì)胞是參與炎癥過程的效應(yīng)細(xì)胞，可以促進(jìn)白細(xì)胞的特異性聚集，并且通過表達(dá)重要的中性粒細(xì)胞黏附配體，重組人細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）在中性粒細(xì)胞遷移、滯留和活化過程中起作用。因此，VA缺乏會(huì)影響COPD患者以中性粒細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)。

大多數(shù)人認(rèn)同，VA缺乏會(huì)影響患兒氣道上皮細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致患兒反復(fù)呼吸道感染；VA補(bǔ)充后能明顯增加幼兒巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的功能，影響細(xì)胞因子IL-1、TNF-α的合成[9]。對(duì)哮喘動(dòng)物模型的研究也證實(shí)，VA與哮喘的炎癥反應(yīng)有關(guān)。陳慧敏等[10]對(duì)哮喘豚鼠的研究表明，補(bǔ)充VA可以減輕哮喘的炎癥反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)隨VA攝入量增加，效果更顯著。方紅等[11]對(duì)哮喘大鼠的研究得出類似結(jié)論，并認(rèn)為VA對(duì)減輕哮喘的炎癥反應(yīng)的作用與TNF有關(guān)。近年來，VA在COPD中的作用在理論以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面得到了多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可，但是仍然有研究得出不同的結(jié)論，并且針對(duì)COPD患者的研究資料較少。2003年，Lucey EC等[12]發(fā)表文章稱，全反式維甲酸治療并不能夠改善成年肺氣腫模型大鼠氣道的大小，也不會(huì)影響彈性蛋白酶及前膠原mRNA的表達(dá)。2004年，F(xiàn)ujita M等[13]的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)視黃醇并不能對(duì)大鼠的肺氣腫產(chǎn)生有益的影響，認(rèn)為VA應(yīng)用于COPD患者對(duì)其癥狀以及肺功能的改善作用并不讓人滿意，可能的原因在于沒有在疾病早期意識(shí)到營(yíng)養(yǎng)支持的重要性并進(jìn)行補(bǔ)充。VA缺乏在COPD患者中普遍存在，10種老年慢性疾病VA水平分析[14]中發(fā)現(xiàn)，肺氣腫和肺心病是發(fā)生VA缺乏率最高的疾病，分別達(dá)到了51.5%和91.6%。并且吸煙等因素導(dǎo)致VA的消耗過多，給予一定劑量的VA補(bǔ)充是必要而且安全的。Mao JT等[15]對(duì)嚴(yán)重肺氣腫患者給予3個(gè)月VA治療，結(jié)果表明，患者對(duì)VA的耐受性較好、不良反應(yīng)輕，并認(rèn)為進(jìn)一步的研究應(yīng)該了解高劑量、長(zhǎng)時(shí)間及不同劑量的可行性。

本課題組的前期研究已經(jīng)對(duì)穩(wěn)定期COPD患者以及健康吸煙成人誘導(dǎo)痰和血清中的IL-8、IL-1β、TNF-α水平及血清中VA水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，穩(wěn)定期COPD患者誘導(dǎo)痰和血清中IL-8、IL-1β、TNF-α較健康吸煙組均升高，本地區(qū)穩(wěn)定期COPD患者血清VA的濃度低于正常成年人（0.56±0.12）mg·L－1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明COPD患者中存在系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。這種改變不僅與支氣管-肺組織的慢性炎癥有關(guān)，而且可加劇COPD的嚴(yán)重程度并可造成全身炎癥反應(yīng)。同時(shí)也提示，穩(wěn)定期COPD患者具有較低的VA水平。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)穩(wěn)定期COPD患者補(bǔ)充VA，觀察其能否調(diào)節(jié)COPD關(guān)鍵細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而延緩病程的進(jìn)展。結(jié)果顯示，補(bǔ)充VA后，2個(gè)治療組患者血清VA的濃度均有不同程度的上升，服藥劑量越大、時(shí)間越長(zhǎng)，血清VA濃度上升越明顯。補(bǔ)充VA1個(gè)月后，細(xì)胞因子水平較治療前無明顯增加，且3組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；3個(gè)月后，2個(gè)VA治療組細(xì)胞因子水平分別較治療前有所下降（P＜0.05），2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6個(gè)月后，2個(gè)治療組細(xì)胞因子水平較3個(gè)月隨訪時(shí)進(jìn)一步下降，治療2組下降較治療1組更明顯（P＜0.05）。由此可以看出，VA可以下調(diào)穩(wěn)定期COPD患者誘導(dǎo)痰和血清中IL-8、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平。TNF-α是細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的初級(jí)因子和觸發(fā)成分，可使上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肺組織的核因子-κB（NF-κB）活性增強(qiáng)，并誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附因子（VCAM-1）的表達(dá)，而VCAM-1參與炎癥過程中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)[16，17]，引起肺損傷，并誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子。IL-1β主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體前炎癥免疫反應(yīng)的主要誘導(dǎo)劑。IL-8是其中最重要的趨化和激活中性粒細(xì)胞（PMN）的細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞在IL-1、TNF-α等誘導(dǎo)下合成與釋放[18]。由此推測(cè)，VA可能是通過抑制TNF-α的表達(dá)[19]，進(jìn)而抑制其他細(xì)胞因子的表達(dá)，起到抗炎作用的。

綜上所述，VA類物質(zhì)作為一類具有多相性調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，對(duì)各種炎癥、免疫和結(jié)構(gòu)細(xì)胞的功能均有調(diào)節(jié)作用。提高對(duì)此類物質(zhì)廣泛生理調(diào)節(jié)作用的認(rèn)識(shí)，將為COPD的防治提供新的思路。

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