21種中草藥提取物對(duì)MRSA的抗菌作用研究

傅若秋，余 瓊，孟德勝，盧來(lái)春，張雪梅（.第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院，重慶市40004；.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市 40075；3.重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，重慶市 40006）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是嚴(yán)重影響人類健康，導(dǎo)致壞死性肺炎、嚴(yán)重?cái)⊙Y、壞死性筋膜炎等疾病的重要致病菌[1]，如何防治已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。萬(wàn)古霉素是臨床上唯一確證對(duì)MRSA有效的藥物，但目前許多國(guó)家（包括中國(guó)）均發(fā)現(xiàn)了對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的MRSA[2]。一旦MRSA發(fā)展到對(duì)萬(wàn)古霉素普遍耐藥，MRSA感染患者將面臨無(wú)藥可治的危險(xiǎn)境地，因此研究開發(fā)針對(duì)MRSA的新的抗菌藥物刻不容緩。天然植物特別是中草藥中蘊(yùn)含著多種多樣的天然活性物質(zhì)，從中篩選抗MRSA藥物是一個(gè)很好的途徑。筆者在對(duì)21種中草藥提取物進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)其中8種具有抗MRSA作用，故對(duì)其進(jìn)行了抗菌活性的初步研究。

1 材料

1.1 瓊脂平板與培養(yǎng)基

血瓊脂平板（CN）、M-H瓊脂平板（重慶龐通醫(yī)療器械有限公司）；Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB，筆者配制，LB配方：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，pH7.2～7.4）。

1.2 藥敏紙片

萬(wàn)古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1.3 中草藥

蒲公英（Taraxaci Herba）、桑葉（Morus alba）、夏枯草（Prunella vulgaris）、半枝蓮（Scutellaria barbata）、木瓜（Chaenomeles sinensis）、仙鶴草（Agrimonia pilosa）、大血藤（Sargentodoxa cuneata）、側(cè)柏葉（Platycladus orientalis）、黃芪（Astragali Radix）、三七（Panax notoginseng）、白花蛇舌草（Oldenlandia diffusa）、淫羊藿（Epimedii Folium）、皂角刺（Gleditsia sinensis）、茵陳（Artemisiae Scopariae Herba）、陳皮（Citrus reticulata）、葛根（Pueraria lobata）、菊花（Chrysanthemum morifolium）、枇杷葉（Eriobotrya japonica）、大薊（Cirsium japonicum）、黨參（Codonopsis Radix）、紫蘇（Perilla frutescens）均由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院中草藥房提供，由筆者鑒定為真品。

1.4 菌種

MRSA臨床分離菌株（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)）。

2 方法

2.1 水提物的制備

稱取每種中草藥各10 g，分別加100 mL純化水浸泡24 h，在電熱帽中加熱煎煮0.5 h，收集濾液，濾渣再加100 mL純化水加熱煎煮0.5 h，重復(fù)3次，合并濾液，過(guò)濾，濃縮至濃度為1 g·mL-1（以1 mL藥液含生藥量1 g計(jì)），滅菌后4℃貯藏，備用。臨用前取出，在無(wú)菌操作臺(tái)上用無(wú)菌純化水倍比稀釋至0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，備用。

2.2 醇提物的制備

稱取每種中草藥各10 g，分別用95%乙醇150 mL浸泡7 d，共浸泡3次，過(guò)濾，合并濾液，回收乙醇，制成浸膏，用無(wú)菌純化水[含5%二甲基亞砜（DMSO）]配成濃度為1 g·mL-1（以1 mL藥液含生藥量1 g計(jì)）的藥液，滅菌后4℃貯藏，備用。臨用前取出，在無(wú)菌操作臺(tái)上用無(wú)菌純化水（含5%DMSO）倍比稀釋至0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，備用。

2.3 菌液的制備

將菌種接種于含LB培養(yǎng)基的試管中，于37℃培養(yǎng)約24 h，用培養(yǎng)基調(diào)整其OD值為0.8，再用培養(yǎng)基稀釋1 000倍，相當(dāng)于菌液濃度為105～106cfu·mL-1，備用。

2.4 抑菌試驗(yàn)

2.4.1 MRSA耐藥性鑒定 采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)試MRSA對(duì)不同抗菌藥的敏感性。將菌液100μL均勻涂于M-H瓊脂平板上，待干后，分別貼上萬(wàn)古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片，于37℃恒溫孵育24 h，測(cè)定抑菌環(huán)的大小，判斷其對(duì)藥物的敏感性。

2.4.2 初篩 于無(wú)菌96孔板中每孔加入菌液190μL和濃度為1 g·mL-1的中草藥提取物10μL，每種中草藥提取物重復(fù)3次；另取菌液190μL、無(wú)菌純化水10μL作為陽(yáng)性菌對(duì)照；取培養(yǎng)基190μL、無(wú)菌純化水10μL作為陰性菌對(duì)照。于37℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察培養(yǎng)液澄清者，表明其對(duì)應(yīng)的中草藥提取物有抑菌作用，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4.3 中草藥提取物抑菌/殺菌作用 于無(wú)菌96孔板中每孔加入菌液190 μL，分別加入濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1初篩有效的中草藥提取物10μL（相當(dāng)于培養(yǎng)體系中提取物濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg·mL-1），每種中草藥提取物每個(gè)濃度重復(fù)3次；另取菌液190μL、無(wú)菌純化水10μL作為陽(yáng)性菌對(duì)照；取培養(yǎng)基190μL、無(wú)菌純化水10μL作為陰性菌對(duì)照。于37℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察培養(yǎng)液澄清者表明所對(duì)應(yīng)濃度的中草藥提取物有抑菌作用。將肉眼觀察到的澄清培養(yǎng)液取20μL轉(zhuǎn)種至血平板中，于37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，血平板中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)濃度的中草藥提取物表明其有殺菌作用。計(jì)算不同濃度中草藥提取物對(duì)11株MRSA的抑菌率和殺菌率。

3 結(jié)果

3.1MRSA耐藥性鑒定

用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥性，可作為臨床實(shí)驗(yàn)室確證MRSA的一種簡(jiǎn)便有效的方法[3]。采用NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，11株MRSA均對(duì)苯唑西林、頭孢西丁、青霉素耐藥，符合MRSA的判斷標(biāo)準(zhǔn)；此外，11株MRSA對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等常見抗生素均不同程度耐藥，符合MRSA多重耐藥特征。11株MRSA對(duì)常見抗生素的耐藥情況分析見表1（S：敏感；M：中介；R：耐藥）。

表1 11株MRSA對(duì)常見抗生素的耐藥情況分析Tab 1 Drug resistance of 11 strains of SRSA against common antibiotics

3.2 初篩結(jié)果

21種中草藥中有8種對(duì)MRSA具有較強(qiáng)的抗菌活性，分別為半枝蓮、仙鶴草、蒲公英、夏枯草、桑葉、木瓜、側(cè)柏葉、大血藤。

3.3 抑菌/殺菌作用測(cè)定結(jié)果

3.3.1 抑菌作用測(cè)定結(jié)果 8種中草藥提取物均對(duì)11株MRSA具有抑菌作用，在50 mg·mL-1濃度下對(duì)11株MRSA的抑菌率均達(dá)到100%，但在1.563 mg·mL-1濃度下對(duì)MRSA均無(wú)抑菌作用（表中略去）。其中，半枝蓮水提物、仙鶴草醇提物的抑菌作用較強(qiáng)，在6.25 mg·mL-1濃度下對(duì)11株MRSA的抑菌率仍達(dá)100%，結(jié)果見表2。

表2 8種中草藥不同濃度提取物對(duì)11株MRSA的抑菌作用測(cè)定結(jié)果Tab 2 Antibacterial effects of 8 extracts of Chinese herbal medicine with different concentrations on 11 strains of MRSA

3.3.2 殺菌作用測(cè)定結(jié)果 8種中草藥提取物均對(duì)11株MRSA具有一定的殺菌作用，其中仙鶴草醇、水提物和半枝蓮、蒲公英、側(cè)柏葉的醇提物在50 mg·mL-1濃度下對(duì)11株MRSA的殺菌率可達(dá)100%；仙鶴草水提物在25 mg·mL-1濃度下對(duì)11株MRSA的殺菌率可達(dá)100%；但所有提取物在≤3.125 mg·mL-1濃度時(shí)對(duì)MRSA均無(wú)殺菌作用。其中，半枝蓮水提物與仙鶴草醇、水提物的殺菌作用較強(qiáng)，在6.25 mg·mL-1濃度下對(duì)11株MRSA的殺菌率分別為18.2%、45.5%、45.5%，結(jié)果見表3。

表3 8種中草藥不同濃度提取物對(duì)11株MRSA的殺菌作用測(cè)定結(jié)果Tab 3 Bactericidal effects of 8 extracts of Chinese herbal medicine with different concentrations on 11 strains of MRSA

4 討論

21種中草藥中，有8種中草藥的水提物和醇提物對(duì)MRSA均有抑制作用，其中仙鶴草醇、水提物和半枝蓮、蒲公英、側(cè)柏葉的醇提物具有較強(qiáng)的殺菌作用。

由試驗(yàn)結(jié)果可見，同一中草藥的醇提物和水提物其抑菌作用可能差別很大，有的醇提物抑菌作用強(qiáng)于水提物，如木瓜同等濃度（12.5 mg·mL-1）醇提物抑菌率為90.9%，其水提物抑菌率為45.5%；而有的水提物作用強(qiáng)于醇提物，如蒲公英同等濃度下（6.25 mg·mL-1）水提物抑菌率為81.8%，其醇提物抑菌率僅為9.1%。而不同中草藥提取物間的抑菌作用差別就更大，如在3.125 mg·mL-1濃度下，半枝蓮醇提物和水提物的抑菌率分別達(dá)到36.4%和81.8%，而其他大多數(shù)中草藥提取物在此濃度下未表現(xiàn)出抑菌活性。

由于各中草藥提取物中所含組分、提取收率等均不盡相同，因此抗菌濃度大小的差異并不能完全真實(shí)反映各提取物所含活性成分之間的作用強(qiáng)度差異。盡管如此，筆者也能從抑菌率/殺菌率結(jié)果中判斷出該提取物是否有明顯的抗MRSA活性。

[1] Maree CL，Daum RS，BoyleVavra S，et al.Community-associated methicillin-resistant staphylococcus aureus isolates causing healthcare-associated infections[J].Emerg-ing Infect Dis，2007，13（2）：236.

[2] 謝紹華，王小華，許 鵬，等.耐萬(wàn)古霉素MRSA重癥肺炎1例報(bào)告[J].江西醫(yī)藥，2010，45（3）：231.

[3] 諶秋華，范叢進(jìn).耐甲氧西林金葡菌的頭孢西丁檢測(cè)法與耐藥性分析[J].中國(guó)抗生素雜志，2005，30（11）：672.

[4] NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Ninteen the Informational Supplement，2009，29（3）：47.