HPLC法同時測定阿托伐他汀鈣片與普羅布考片中2主分含量

孫成龍，梁 浩，韓衍銀，李 珂，齊永秀（泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安市271016）

阿托伐他汀鈣為選擇性3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，能降低血漿膽固醇和甘油三酯水平。普羅布考具有抗氧化作用，能夠預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生。阿托伐他汀鈣與普羅布考聯(lián)合用藥是近幾年提出的一種調(diào)脂治療聯(lián)合方案[1，2]。目前測定阿托伐他汀鈣片劑含量的方法主要有紫外分光光度（UV）法、高效液相色譜（HPLC）法和毛細管區(qū)帶電泳法[3～5]；測定普羅布考片劑含量的方法主要有UV法和HPLC法[6，7]。由于二者在臨床聯(lián)合應(yīng)用極為廣泛，但尚未見同時測定二者血藥濃度的有關(guān)報道，建立此方法可為臨床測定二者的血藥濃度提供參考。由于HPLC法專一性強、靈敏度高，但采用外標(biāo)法，易產(chǎn)生操作誤差。為此，筆者選用丹皮酚為內(nèi)標(biāo)，建立了同時測定阿托伐他汀鈣與普羅布考含量的HPLC內(nèi)標(biāo)法。結(jié)果表明，此法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，而且節(jié)省時間、資源，可以為同時測定二者在制劑中的含量或受試體中的血藥濃度提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10AT型HPLC儀、SPD-10A型紫外檢測器（日本島津公司）；N2000雙通道色譜工作站、GR-202電子分析天平（日本AND公司）。

阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100590-200802，按三水合物計含量為95.0%）、普羅布考標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100560-200301，供含量測定用）、丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110708-200505，供含量測定用）均由中國藥品生物制品檢定所提供；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司進口分裝，批號：138709K，規(guī)格：每片10 mg）；普羅布考片（承德頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司，批號：100403077，規(guī)格：每片0.25 g）；甲醇為色譜純，醋酸銨、冰醋酸均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為200 μg·mL－1的阿托伐他汀鈣貯備溶液。精密稱取普羅布考標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為400 μg·mL－1的普羅布考貯備溶液。分別精密量取2種貯備溶液各2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為500 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 供試品溶液。取阿托伐他汀鈣片20片，研細，精密稱取細粉適量（約相當(dāng)于阿托伐他汀鈣10 mg），置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過。精密量取續(xù)濾液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得阿托伐他汀鈣貯備溶液（濃度約為20 μg·mL－1）。取普羅布考片20片，研細，精密稱取細粉適量（約相當(dāng)于普羅布考20 mg），其余操作及制備濃度同阿托伐他汀鈣供試品溶液。分別精密量取2種貯備溶液各2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.1.4 空白溶液。取處方量的空白輔料，置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量充分振搖后稀釋至刻度，濾過；精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

2.2 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-醋酸銨緩沖液（pH 4.0）＝95∶5，流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為246 nm；進樣量為20 μL。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.1”項下空白溶液及標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液（加入內(nèi)標(biāo)溶液），按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結(jié)果空白溶液對主成分測定無干擾，理論板數(shù)按阿托伐他汀鈣峰計不低于1 500，2個主峰與內(nèi)標(biāo)峰具有較好的峰形且分離度良好，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶液；B.供試品溶液；C.標(biāo)準(zhǔn)品溶液；1.阿托伐他汀鈣；2.內(nèi)標(biāo)；3.普羅布考Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solution；B.test sample solution；C.reference substance solution；1.atorvastatin calcium；2.internal standard；3.probucol

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取阿托伐他汀鈣貯備溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各精密加入普羅布考貯備溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL及內(nèi)標(biāo)溶液2.0 mL，用甲醇稀釋制備成含阿托伐他汀鈣濃度分別為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg·mL－1，含普羅布考濃度分別為10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，進樣20 μL；分別以2組分濃度（X）與二者各自的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）進行線性回歸，得回歸方程：阿托伐他汀鈣：Y＝0.041 9X+0.017 3（r＝0.999 9，n＝6），普羅布考：Y＝0.037 3X+0.029 6（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，阿托伐他汀鈣、普羅布考檢測濃度線性范圍分別為5.0～50.0、10.0～100.0 μg·mL－1。

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品，分別精密稱取9份，每份準(zhǔn)確加入阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品溶液、普羅布考標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備成高、中、低濃度的溶液，每一濃度3份，按“2.1.3”項下方法制備，并按“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液，在室溫下放置2、4、8、12 h，測定峰面積。結(jié)果阿托伐他汀鈣、普羅布考的峰面積的RSD分別為1.2%、1.1%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度試驗

制備阿托伐他汀鈣和普羅布考高、中、低（40、20、10 μg·mL－1）3種濃度的溶液各3份，加入2 mL的內(nèi)標(biāo)溶液，分別在當(dāng)日內(nèi)重復(fù)測定3次和3 d內(nèi)重復(fù)測定3次，以測得的阿托伐他汀鈣峰、普羅布考峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比計算方法的精密度。結(jié)果阿托伐他汀鈣日內(nèi)RSD＜0.96%（n＝3）、日間RSD＜1.99%（n＝3）；普羅布考日內(nèi) RSD＜0.56%（n＝3）、日間RSD＜1.54%（n＝3）。

2.8 樣品含量測定

分別取阿托伐他汀鈣和普羅布考2種片劑各20片，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算含量，結(jié)果分別為標(biāo)示量的100.2%、100.7%。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

3 討論

（1）分析阿托伐他汀鈣與普羅布考的紫外吸收光譜，結(jié)果前者在247 nm波長處有最大吸收，后者在219、243 nm波長處有最大吸收，因此綜合后選用246 nm作為檢測波長。

（2）阿托伐他汀鈣呈弱酸性，采用中性有機溶劑為流動相，獲得峰形不理想。通過調(diào)整緩沖液的pH值，結(jié)果在pH為4.0時，可以獲得理想的色譜圖，而且此條件下普羅布考峰形良好。

（3）普羅布考極性較弱，通過調(diào)整甲醇-醋酸銨緩沖液（pH 4.0）比例（85∶15、90∶10、95∶5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在比例為95∶5時普羅布考保留時間恰當(dāng)，峰形良好。

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