牛乳清蛋白遺傳多態(tài)性研究

曹喻，崔艷華，曲曉軍，董愛軍，馬鶯

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

牛乳清蛋白遺傳多態(tài)性研究

曹喻1，崔艷華1，曲曉軍2，董愛軍1，馬鶯1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

就牛乳清蛋白遺傳多態(tài)性及其研究方法以及乳清蛋白多樣性與乳品質(zhì)之間的相關(guān)性作以闡述，旨在揭示當(dāng)前該方向研究現(xiàn)狀，并為今后研究提供參考。

乳清蛋白；遺傳多態(tài)性；遺傳變異體

0 引言

牛乳蛋白中主要包含兩大類蛋白，即酪蛋白和乳清蛋白。其中，酪蛋白主要包括αS1-酪蛋白（αS1-CN）、αS2-酪蛋白（αS2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）及κ-酪蛋白（κ-CN）。乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白（β-LG）。這6種乳蛋白的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)占牛乳總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的90%。酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占總蛋白的76%～78%，為牛乳中的主要成分。與酪蛋白相比，乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，僅占總蛋白的12%～14%[1，2]。由于牛乳的組成（如乳脂率、乳蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與成分）以及牛乳的理化性狀均與乳蛋白遺傳多態(tài)性密切相關(guān)，因此近年來對(duì)于乳蛋白遺傳多態(tài)性研究逐漸增多，但主要集中在酪蛋白方面，對(duì)乳清蛋白的研究相對(duì)較少[3]。本文就當(dāng)前乳清蛋白多態(tài)性研究作以闡述。

1 牛乳清蛋白的遺傳多態(tài)性

1.1 β-LG的遺傳多態(tài)性

β-LG約占牛乳總蛋白的10%～15%[4]。β-LG由LGB基因編碼[5，6]，定位于?；蚪M的第11號(hào)染色體上（圖1）[7]，為162個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白[8]。β-LG中含有5個(gè)二硫鍵，其中4個(gè)為鏈內(nèi)二硫鍵，1個(gè)為鏈間二硫鍵[9]。目前，在不同來源的牛乳中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的β-LG的變異體有11種，即變異體A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和W（見表1）[10]。其中變異體B在不同來源的牛乳中出現(xiàn)頻率最高，為β-LG的家族模式蛋白[10]，由162個(gè)氨基酸組成，其分子量為18277u。β-LG的信號(hào)肽由16個(gè)氨基酸組成，因此β-LG的前體為178個(gè)氨基酸。在目前的研究中，β-LG的變異體β-LG A、B、C、D、I、J、W具有精確測(cè)序數(shù)據(jù)，而β-LG H、E、F、G則沒有精確的測(cè)序數(shù)據(jù)[11-14]。

圖1 編碼乳清蛋白β-LG（A）和α-LA（B）的基因的結(jié)構(gòu)[7]

1.2 α-LA的遺傳多態(tài)性

α-LA占牛乳中乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5%[15]。由LAA基因編碼[5]，定位于?；蚪M的第5號(hào)染色體上（圖1）[7]。α-LA由123個(gè)氨基酸組成，為球狀蛋白。α-LA的信號(hào)肽由19個(gè)氨基酸組成，因此α-LA的前體為142個(gè)氨基酸。目前，在不同來源的牛乳中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的α-LA的變異體有3種，即變異體A、B和C（見表2）[10]。在不同來源的牛乳中出現(xiàn)頻率較高的兩種α-LA為變異體A和B。變異體A在大部分瘤牛品種中均存在，而在一些意大利及東歐黃牛品種中出現(xiàn)的頻率則較低。變異體B為最常見，出現(xiàn)于大部分黃牛及瘤牛品種中[16]，為α-LA的家族模式蛋白[10]，其分子量為14178 u。α-LA的主要變異位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)第10個(gè)氨基酸處，變異體A所含有的氨基酸為Glu，變異體B含有的氨基酸則是Arg[17]。目前變異體A和B的序列已經(jīng)被精確測(cè)得[18]，而變異體C的精確序列還沒有測(cè)得[19]。學(xué)者研究表明，在牛乳中，α-LA不僅作為牛乳蛋白中的一部分存在，還對(duì)乳糖的生成及牛乳的分泌起到了調(diào)控作用[20，21]。

表1 牛乳β-LG遺傳變異體的差異和分布[10]

表2 牛乳α-LA遺傳變異體的差異和分布[10]

2 乳清蛋白遺傳多態(tài)性研究的方法

自從對(duì)β-乳球蛋白的主要變異體鑒定以來，對(duì)牛奶中乳蛋白遺傳多態(tài)性的研究已經(jīng)開展了半個(gè)世紀(jì)[22]，而近年來遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展則加速了其發(fā)展。對(duì)于牛乳蛋白遺傳多態(tài)性的分析主要從蛋白質(zhì)水平和核酸水平兩方面進(jìn)行，研究方法有很多，如電泳技術(shù)、等電聚焦技術(shù)、離子交換高效液相色譜、質(zhì)譜以及PCR-SSCP和PCR-RFLP等等[2,23]。對(duì)蛋白遺傳多態(tài)性的研究，常用的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳及以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)，特別是PCR-RFLP技術(shù)，在近年來對(duì)蛋白遺傳多態(tài)性的研究及對(duì)不同基因型的測(cè)定中，已經(jīng)成為了重要分析手段[2,8]。以下將分別介紹從蛋白質(zhì)水平及核酸水平對(duì)乳清蛋白遺傳多態(tài)性進(jìn)行研究時(shí)常用的方法。

2.1 蛋白質(zhì)水平

2.1.1 蛋白質(zhì)電泳

常規(guī)蛋白質(zhì)電泳（protein electrophoresis）技術(shù)有酸性電泳、堿性電泳、雙向電泳、等點(diǎn)聚焦、毛細(xì)管電泳、免疫印跡等，它們主要用于蛋白質(zhì)水平的常規(guī)分型，只能檢測(cè)出產(chǎn)生氨基酸替換或等電點(diǎn)變化等可導(dǎo)致電泳結(jié)果變化的遺傳變異類型[2,23]。Lunden等人使用酸性和堿性PAGE電泳對(duì)瑞典紅牛、白牛及荷斯坦牛進(jìn)行αs1-CN、β-CN、κ-CN及β-LG的基因型測(cè)定，研究表明β-LG B等位基因?qū)εＨ槔业鞍捉M成及酪蛋白占總蛋白比率呈現(xiàn)正向相加效應(yīng)[24]。若蛋白質(zhì)在核酸水平上發(fā)生了變異但此種變異未導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生變化，即在蛋白質(zhì)水平上未發(fā)生變異，則稱此種變異體為沉默變異體，常規(guī)蛋白質(zhì)電泳無法對(duì)沉默變異體進(jìn)行檢測(cè)[2]。此種情況下，使用高效液相色譜技術(shù)（HPLC,high performance liquid chromatography）可以檢測(cè)出沉默變異體[25]。

核酸水平上的檢測(cè)則可以更深入的對(duì)導(dǎo)致乳蛋白遺傳變異的原因作出分析，并且一些蛋白變異體在用于蛋白電泳的PAGE緩沖液中溶解效果較差[3]，因此在對(duì)乳蛋白進(jìn)行研究時(shí)，可先對(duì)其進(jìn)行表型水平上的分析，再進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行核酸水平上的分析。

2.1.2 等電聚焦電泳

等電聚焦電泳（IEF,isoelectric focusing electrophoresis）對(duì)于生物品種和種群在表型水平上的篩選最為有效，尤其在對(duì)于生物多態(tài)性的研究方面有很突出的效果。在對(duì)乳蛋白遺傳多態(tài)性的研究中，利用IEF，對(duì)于一些珍稀動(dòng)物，只需獲得其乳樣即可進(jìn)行關(guān)于其蛋白遺傳多態(tài)性的研究[23]。IEF快速、價(jià)格低廉，并且一次可以同時(shí)獲取6種主要乳蛋白基因的表型表達(dá)數(shù)據(jù)，而DNA水平的檢測(cè)僅能每次分析一種乳蛋白[26]。CAROLI等人使用IEF研究了αS1-CN、β-CN、κ-CN及β-LG的遺傳多態(tài)性，對(duì)Reggiana黃牛、意大利黑白花牛、意大利褐牛的遺傳分化進(jìn)行了比較[27]。

2.2 核酸水平

核酸水平分析可獨(dú)立于表型表達(dá)完成，并且不僅可以揭示編碼區(qū)，還能夠區(qū)分非編碼區(qū)和側(cè)翼區(qū)的差異[2]。目前對(duì)編碼牛乳蛋白的基因核酸水平進(jìn)行分析的方法已成熟，也是研究乳蛋白遺傳多態(tài)性的常用方法，主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP、直接測(cè)序、等位基因特異PCR和基因芯片等。由于PCR-RFLP與PCR-SSCP兩種方法具有易于操作、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低等特點(diǎn)，因此在乳蛋白研究中應(yīng)用更為普遍[2]。對(duì)牛乳蛋白位點(diǎn)的遺傳分型及DNA的PCR擴(kuò)增技術(shù)可得到較精確的結(jié)果，且能在DNA水平上對(duì)乳蛋白基因型進(jìn)行分析，從生物體內(nèi)獲得DNA的途徑也多于獲得乳蛋白的途徑，因此在研究中應(yīng)用廣泛[28，29]。

2.2.1 PCR-RFLP分析

PCR-RFLP即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（Polymerase Chain Reaction and Restriction Fragment Length Polymorphism）。牛乳基因應(yīng)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，再用特定限制性內(nèi)切酶對(duì)所得片段進(jìn)行切割，直接利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)分析可得到牛乳蛋白的不同基因型。Karimi等人使用PCRRFLP的方法得到伊朗Najdi牛的β-LG基因序列，并對(duì)其遺傳多態(tài)性及與乳制品特性間的關(guān)系進(jìn)行了分析[8]。

2.2.2 SSCP分析

PCR-SSCP即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism）是在PCR的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸水平分析技術(shù)。單鏈DNA段具有的復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力維持，當(dāng)構(gòu)成DNA的堿基發(fā)生改變時(shí)，單鏈DNA段的空間結(jié)構(gòu)也會(huì)相應(yīng)發(fā)生不同程度的改變，而這種微小的變化會(huì)導(dǎo)致此單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中運(yùn)動(dòng)時(shí)所受阻力發(fā)生改變，最終通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中遷移距離的不同體現(xiàn)出來。因此，PCR-SSCP技術(shù)可以敏銳的檢測(cè)出目標(biāo)乳蛋白基因片段中堿基具有的差異。Kaminski和Zabolewicz使用SSCP的方法，發(fā)現(xiàn)了β-LG 5'側(cè)翼區(qū)位于-501與-293之間位置的6個(gè)變異體[30]。SSCP技術(shù)同樣具有可以檢測(cè)出沉默變異體的能力。Prinzenberg和Erhardt等人使用PCR-SSCP技術(shù)在黃牛與瘤牛的雜交品種中檢測(cè)到一種κ-CN的沉默變異體，這種變異體后來被命名為κ-CNA(1)變異體[31]。

3 乳清蛋白遺傳多態(tài)性對(duì)牛乳性狀的影響

乳蛋白的組成在很大程度上影響著產(chǎn)乳量、乳成分、乳凝結(jié)性等指標(biāo)。牛乳中乳蛋白的組成變化受很多因素的影響，如遺傳因素、季節(jié)變化、牛的品種不同、泌乳階段不同、牛的飼養(yǎng)及健康狀況等等，其中，最主要的因素是遺傳因素[5,31]。對(duì)于乳蛋白，遺傳多態(tài)性指每種乳蛋白所具有兩種或更多種的遺傳形式，這些遺傳形式是由常染色體和共顯性等位基因決定的[32]。當(dāng)牛體內(nèi)負(fù)責(zé)編碼產(chǎn)生相應(yīng)乳蛋白的基因產(chǎn)生變化時(shí)，由此種基因編碼生成的氨基酸發(fā)生了變化，相應(yīng)的乳蛋白結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了變化，導(dǎo)致了乳蛋白的遺傳多態(tài)性，進(jìn)而為牛乳帶來不同的理化性狀[1]。

研究乳蛋白遺傳多態(tài)性主要有以下目的：（1）利用乳蛋白多態(tài)型基因頻率估計(jì)不同品種間親緣關(guān)系，研究品種的起源分化[33]；（2）研究基因、蛋白遺傳多態(tài)性與牛產(chǎn)乳各項(xiàng)性能指標(biāo)間關(guān)系，為育種提供理論依據(jù)；（3）研究蛋白遺傳多態(tài)性對(duì)于乳品生產(chǎn)的影響，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)[34]。

β-Lg是牛中發(fā)現(xiàn)最早和研究最多的乳蛋白基因[35]，與酪蛋白相比，乳清蛋白的蛋白遺傳多態(tài)性通常較低，但眾多研究也證明β-Lg的遺傳多態(tài)性對(duì)于牛乳性狀具有一定影響。這些影響主要體現(xiàn)在牛乳的組成、凝乳特性及熱穩(wěn)定性方面。相比之下對(duì)于α-LA遺傳多態(tài)性對(duì)牛乳性狀的影響的研究則較少。

3.1 乳的組成

β-LG遺傳多態(tài)性對(duì)乳組成的影響主要體現(xiàn)在對(duì)乳的乳脂率的影響。研究者大多使用荷斯坦奶牛進(jìn)行β-LG的相關(guān)研究，研究結(jié)果表明，β-LG B基因型與牛乳中的乳脂率及酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)密切相關(guān)，而β-LG A基因型與乳清蛋白的增加有關(guān)[36，37]。乳的蛋白組成，在很大程度上決定了乳的營養(yǎng)價(jià)值和生產(chǎn)技術(shù)特性。

3.2 凝乳特性

在干酪的生產(chǎn)中，所采用的原料乳的凝乳特性對(duì)干酪的生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量有很大影響，通常具有較短凝聚并結(jié)塊時(shí)間的原料乳生產(chǎn)得到的干酪質(zhì)量較好[38]。研究表明，κ-CN對(duì)于乳的凝乳特性具有較大影響，但其他乳蛋白尤其是β-CN和β-LG，與κ-CN的相互作用必須充分考慮。含有BB型β-LG的乳通常具有較高的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白、酪蛋白和固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，能縮短凝乳時(shí)間，加固奶酪凝乳的密度，提高奶酪的產(chǎn)量，在生產(chǎn)中更利于凝乳，適合干酪的加工[37,39，40]。

干酪生產(chǎn)中的凝乳時(shí)間和凝塊硬度等特性依賴于乳中酪蛋白的組成。增加酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有助于提高干酪產(chǎn)量[37]。對(duì)β-LG蛋白大多數(shù)研究表明β-LG BB基因型可導(dǎo)致牛乳中酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，因此通常含有β-LG BB基因型的牛乳具有較高的理論干酪產(chǎn)量，且干酪終產(chǎn)量與β-LG BB在牛乳中質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比[36，37]。Heck等人對(duì)荷斯坦奶牛進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與A型變異體相比，基因型為β-LG BB的牛乳中，盡管β-LG質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，但乳中α-LA、αS1-CN、αS2-CN、β-CN及κ-CN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，這一特點(diǎn)非常利于干酪生產(chǎn)[1]。

3.3 熱穩(wěn)定性

在牛乳的加工過程中，高溫工序如預(yù)熱、巴氏殺菌、超高溫滅菌等常常是不可避免的。這些工序往往會(huì)導(dǎo)致乳中蛋白質(zhì)高溫變性，乳的性狀也隨之發(fā)生變化。不同生產(chǎn)中對(duì)乳的熱穩(wěn)定性要求不同。Imafidon等人研究表明，β-LG不同變異體的熱穩(wěn)定存在差異，同時(shí)其熱穩(wěn)定性受乳中的κ-CN變異體類型及CaCl2影響。β-LG BB型的熱穩(wěn)定性高于其他類型變異體。κ-CN AA型提高乳熱穩(wěn)定性，而κ-CN BB和AB型則降低熱穩(wěn)定性。β-LG BB或AB與κ-CN AA的組合可以使乳的熱穩(wěn)定性最大，而β-LG AA與κ-CN AA，以及β-LG AA與κ-CN BB組合的熱穩(wěn)定性低[41]。

4 結(jié)束語

乳清蛋白α-LA和β-LG的蛋白多態(tài)性與乳制品（奶酪等）實(shí)際生產(chǎn)性能密切相關(guān)，因此乳清蛋白遺傳多態(tài)性研究具有理論價(jià)值的同時(shí)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)乳清蛋白多態(tài)性的研究多采用傳統(tǒng)方法，因此發(fā)展新型的、簡便快捷的分析方法具有很大的價(jià)值。牛乳中乳清蛋白多態(tài)性研究，將為牛品種選育提供參考，進(jìn)而達(dá)到調(diào)整牛乳中乳蛋白成分，改善牛乳生產(chǎn)性能的目的；并為物種起源分化提供寶貴資料，因此具有較大發(fā)展空間。

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Whey protein polymorphisms in cattle milk

CAO Yu1,CUI Yan-hua1，QU Xiao-jun2,DONG Ai-jun1,MA Ying1
(1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Science Academy,Harbin 150010,China)

In this paper,whey protein polymorphism,its research methods and the correlation between whey protein polymorphism and milk quality were reviewed.The aim of this paper is to illustrate the current research status of whey protein polymorphism and to provide reference for future researches.

whey protein;genetic polymorphism;genetic variant

Q933

B

1001-2230（2011）05-0043-04

2011-030-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30871953，31071571）。

曹喻（1989-），女，本科，研究方向?yàn)闉榕Ｈ榈鞍锥鄻有浴?/p>

馬鶯