三氧化二砷對腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管形成及其凋亡的影響

傅文達，王雪雯，張建華

（石河子大學醫(yī)學院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002）

三氧化二砷對腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管形成及其凋亡的影響

傅文達，王雪雯，張建華

（石河子大學醫(yī)學院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002）

為了探討三氧化二砷（As2O3）對腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管形成及其凋亡的機制，采用肝癌Hep G2細胞上清誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）成為腫瘤血管內(nèi)皮細胞（tumor－derived endothelial cells，Td－EC），通過細胞遷移、流式細胞術、血管形成實驗檢測As2O3對HUVEC與Td－EC增殖、遷移、血管形成及其凋亡的影響。結果顯示，在同樣條件下與HUVEC相比，As2O3在體外抑制Td－EC增殖、遷移和血管的形成及其促進凋亡的作用顯著。結論：As2O3在體外可特異地抑制Td－EC增殖、遷移、血管形成及其凋亡。

As2O3；腫瘤血管內(nèi)皮細胞；凋亡；遷移；血管形成

實質(zhì)腫瘤的增長依賴于血管新生，新生血管為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣，并能帶走代謝產(chǎn)物，因而抗腫瘤的血管治療成為目前治療腫瘤的研究方向之一［1］。三氧化二砷（As2O3）是我國傳統(tǒng)中藥，能夠抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，促進凋亡。

本研究中，我們將探討As2O3體外抗血管形成的效應，以期揭示其對腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長及相關功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

參照文獻［2］中的方法進行。臍帶取自石河子大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科的健康、足月剖宮產(chǎn)胎兒，以胰酶灌注法分離臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，用ECM培養(yǎng)傳代，免疫熒光法檢測Ⅷ因子相關抗原以鑒定HUVEC。人肝癌Hep G2細胞用含10%新生牛血清的DMEM液培養(yǎng)至70%匯合時，換成無血清的DMEM液再培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，于－80℃保存?zhèn)溆?。取?代HUVEC，用含體積分數(shù)50%Hep G2細胞培養(yǎng)上清的ECM培養(yǎng)，匯合至80%時收集細胞，即為腫瘤血管內(nèi)皮細胞（Td－EC），并可培養(yǎng)傳代。

1.2 RT－PCR檢測TEM1和TEM8

以正常HUVEC為對照組，按Trizol法提取總RNA。根據(jù)TEM1及TEM8的c DNA設計引物，并由上海生物工程技術有限公司合成。擴增TEM1基因片段為287 bp，上游引物：5′－TCGAGTGTTATTGTAGCGAGGGACATG －3′，下游引物：5′－AGGTGGGCTCCGGGTAGGGTAT－3′；擴增 TEM8 基因片段為462 bp，上 游 引 物：5′－CGGATTGCGGACAGTAAGG－3′，下 游 引 物：5′－GCCAGAACCACCAGAGGAG－3′；按Fer mentas RT－PCR試劑盒的說明書進行擴增。凝膠電泳成像系統(tǒng)攝像。

1.3 內(nèi)皮細胞遷移

參照文獻［3］中的方法，將小室放入24孔培養(yǎng)板中，在上室加入300μL預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，吸去剩余培養(yǎng)液，24孔板下室加入600μL含ECM培養(yǎng)基，放入小室，取細胞懸液1.0×105／mL 200μL加入Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，95%酒精常溫固定30 min，0.1%結晶紫常溫染色10 min，清水漂凈，取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)，并取其均數(shù)，將上室液更換為2μmol／L As2O3的培養(yǎng)液，重復以上實驗步驟，研究As2O3對內(nèi)皮細胞遷移特性的影響。

1.4 流式細胞檢測細胞凋亡

將HUVEC、Td－EC內(nèi)皮細胞各分為2組，共4組，每組3孔接種到6孔板內(nèi)。24 h后，HUVEC及Td－EC實驗組換為2μmol／L As2O3無血清培養(yǎng)液，其余2組為對照組，培養(yǎng)48 h后，以0.25% 胰酶消化，收集細胞，800 r／min離心5 min，0.01 mol／L PBS漂洗3次，吹打成單細胞懸液，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為2.0×105／mL，Annexin V－FITC／PI雙染，以激發(fā)光488 n m，檢測光610 nm流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 血管形成實驗

在24孔板中加入40μL matrigel膠（按1∶2比例與預冷無血清DMEM混合），置于室溫下30 min，待其凝固。將 HUVEC、Td－EC按1.5×105／mL接種于此，每4 h觀察1次管腔形成情況，12 h終止。培養(yǎng)基中加入2μmol／L As2O3繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察。每孔取10個視野計數(shù)，取其平均數(shù)。

1.6 繪制細胞生長曲線

取96孔板，每孔加，3×105／mL單細胞懸液，加入干預因素2μmol／L As2O3，對照組為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設3個復孔，每天每組3個孔，每組先吸出培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入0.25%胰酶消化并吹打，血球計數(shù)板計數(shù)，共7 d，取其均數(shù)，并繪制生長曲線。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 HUVEC的分離培養(yǎng)及鑒定

細胞接種24 h后，普通光鏡下可見細胞貼壁，初長出的細胞為梭形，第3－5天，細胞長成片，中心排列緊密部分可見呈典型鋪路石樣排列的單層細胞（圖1a）。培養(yǎng)的細胞經(jīng)熒光免疫染色后，共聚焦顯微鏡下可見細胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光，細胞內(nèi)有內(nèi)皮細胞特有的人Ⅷ因子相關抗原存在（圖1b）。

圖1 誘導前后HUVEC的觀測結果Fig.1 Observations of HUVEC induced before and after

2.2 腫瘤血管內(nèi)皮細胞的誘導生成及鑒定

經(jīng)誘導后的成為Td－EC細胞核變大，細胞質(zhì)豐富，增殖更快（圖1c），并可以繼續(xù)傳代培養(yǎng)。RTPCR擴增產(chǎn)物的電泳結果見圖2。

圖2 TEM1和TEM8在HUVEC、Td－EC中的表達Fig.2 Expression of TEM1 and TEM8 in HUVEC and Td－Ec

由圖2可知，從Td－EC中能擴增出約287 bp及460 bp的條帶（圖2），說明HUVEC經(jīng)Hep G2細胞培養(yǎng)上清誘導后，細胞表達TEM1和TEM8，這是腫瘤血管內(nèi)皮細胞特有的表達抗原，故誘導細胞具備了腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特性。

2.3 內(nèi)皮細胞遷移試驗

由圖3和表1可見，HUVEC、Td－EC分別加入As2O3培養(yǎng)前后二者差異顯著（P＜0.01），而兩細胞加入As2O3培養(yǎng)二者間差有統(tǒng)計學差異 （P＜0.05），且正常HUVEC細胞與Td－EC細胞比較差異顯著（P＜0.05）。這表明Td－EC細胞較正常內(nèi)皮細胞具有更強的遷移能力，利于腫瘤的血管新生，As2O3能顯著抑制Td－EC的遷移能力。

表1 各分組HUVEC、Td－EC遷移細胞數(shù)，n＝5Tab.1 The migration of HUVEC and Td－Ec in different groups

表1 各分組HUVEC、Td－EC遷移細胞數(shù)，n＝5Tab.1 The migration of HUVEC and Td－Ec in different groups

注：a為加藥組與空白組，P＜0.01；b為兩細胞用藥組P＜0.05，c：空白組之間P＜0.05。

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圖3 As 2 O3 對HUVEC、Td－EC細胞遷移的影響（10×40）Fig.3 Effects of As2 O3 in migration of HUVEC and Td－EC cells

2.4 流式細胞檢測細胞凋亡

由圖4和表2可見，As2O3加入前后的HUVEC與Td－EC間早期凋亡率比較差異顯著（P＜0.05），而空白組 Td－EC較 HUVEC低（P＜0.05）。

圖4 As2 O3對HUVEC、Td－EC凋亡的影響Fig.4 Effect of As2 O3 on apoptosis in HUVEC and Td－EC

表2 各分組HUVEC、Td－EC凋亡率，n＝3Tab.2 Apoptosis of HUVEC and Td－EC in diffcrent groups

表2 各分組HUVEC、Td－EC凋亡率，n＝3Tab.2 Apoptosis of HUVEC and Td－EC in diffcrent groups

注：a為加藥組與空白組，P＜0.05；b為兩細胞用藥組，P＜0.05；c為空白組之間，P＜0.05。

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2.5 血管形成實驗

加入As2O3前后培養(yǎng)的HUVEC和Td－EC管腔形成的數(shù)目有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），且空白組的 HUVEC與Td－EC細胞有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖5）。這表明Td－EC細胞較正常內(nèi)皮細胞具有更強的血管形成能力，利于腫瘤的生長和轉移，As2O3能顯著抑制Td－EC的血管形成能力，且比對正常內(nèi)皮細胞的影響更顯著。

表3 各分組的HUVEC、Td－EC管腔形成數(shù)，n＝10Tab.3 The cavity number of HUVEC and Td－EC in different groups

表3 各分組的HUVEC、Td－EC管腔形成數(shù)，n＝10Tab.3 The cavity number of HUVEC and Td－EC in different groups

注：a為加藥組與空白組，P＜0.01；b為兩細胞用藥組，P＜0.05；c為空白組之間，P＜0.05。

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圖5 As 2 O3 對HUVEC、Td－EC血管形成的影響（10×40）Fig.5 Effect of As 2 O3 on neovascularization in HUVEC and Td－EC（10×40）

2.6 細胞生長曲線

通過對HUVEC和Td－Ecd增殖對比研究顯示，加入As2O3前后，HUVEC和Td－EC的增殖均明顯受到抑制，且Td－EC受到的抑制更明顯（P＜0.05），而空白組的Td－EC增殖比 HUVEC更明顯（P＜0.05）（圖6）。

圖6 As 2 O3對HUVEC、Td－EC生長的影響Fig.6 Effect of As2 O3 on the growth of HUVEC and Td－EC

3 討論

人臍靜脈內(nèi)皮細胞被公認為研究抗血管形成機制的細胞水平的標準模型［3］，但腫瘤血管內(nèi)皮細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞仍存在不同，如：形態(tài)、表型、功能及基因的表達上存在差異，且由于腫瘤血管內(nèi)皮細胞屬微血管內(nèi)皮細胞，含量極少，分離復雜，體外培養(yǎng)困難，且費用昂貴，限制了研究的開展。所以，找到合適的實驗模型對于抗腫瘤研究至關重要。本研究參照向邦德等［2］報道的方法，采用肝癌Hep G2細胞培養(yǎng)上清刺激HUVEC生長的方法來得到腫瘤血管內(nèi)皮細胞，在與腫瘤細胞上清混合培養(yǎng)環(huán)境中，HUVEC細胞生長環(huán)境類似在體腫瘤內(nèi)血管。本研究中，HUVEC與肝癌Hep G2細胞上清共培養(yǎng)3～5 d后，檢測到細胞表達TEM1和TEM8腫瘤血管內(nèi)皮細胞特異性抗原，通過實驗證實Td－EC有較強的增殖和遷移能力，與HUVEC比較差異顯著，說明刺激后生成的內(nèi)皮細胞具有腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特性。有研究發(fā)現(xiàn)，通過人肺腺癌A549細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)HUVEC亦能具有腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特性［5］，而通過對A549細胞培養(yǎng)上清液的研究表明，在上清液中包含多種生長因子，如VEGF、b FGF等，繼而改變HUVEC增殖調(diào)控，是細胞增殖更活躍［6］，這可能也是肝癌Hep G2細胞培養(yǎng)上清刺激HUVEC具有腫瘤血管內(nèi)皮細胞特性的機制。所以，Td－EC作為研究As2O3在體外抗血管生成作用機制的研究模型，比HUVEC更具有代表性。

本研究證實As2O3在體外對于腫瘤血管內(nèi)皮細胞，在細胞遷移、增殖、凋亡及血管形成等多方面有顯著抑制作用，相對正常內(nèi)皮細胞影響明顯，這對于探討As2O3抑制腫瘤血管的生長有重要意義。很多實驗都證實［7－8］，As2O3能顯著抑制 HUVEC的增殖并可促進凋亡，動物實驗證實可以抑制實體移植腫瘤生長，以及抑制血管新生等方面都有顯著的作用。但是，目前對于血管內(nèi)單個的腫瘤血管內(nèi)皮細胞的作用效應的相關研究少有報道。在臨床用藥中As2O3血藥濃度為1.0～4.0μmol／L，而前期研究［9］也發(fā)現(xiàn)As2O3濃度≤1.0μmol／L時，可以促進Hep G2細胞的增殖，濃度≥2.0μmol／L則抑制Hep G2細胞增殖，故本實驗 As2O3濃度取2.0 μmol／L，該濃度既能抑制內(nèi)皮細胞的增殖，同時對腫瘤細胞的增殖亦有抑制作用。經(jīng)肝癌Hep G2細胞培養(yǎng)上清刺激HUVEC生長的方法來得到腫瘤血管內(nèi)皮細胞，能高表達VEGFR2［2］，而 As2O3可以通過VEGF信號傳導途徑影響腫瘤內(nèi)皮細胞的功能［10］，這可能是 As2O3對 Td－EC作用更明顯的原因。該研究可為As2O3臨床抗肝癌治療提供理論基礎和實踐意義。

［1］Folk man J.Tumor angiogenesis：therapeutic i mplieations［J］.N Engl J Med，1971，285（21）：1182－1186.

［2］向邦德，呂明德，黃吉夫，等，誘導正常內(nèi)皮細胞具備腫瘤血管特性的研究［J］.中山大學學報：醫(yī)學科學版，2005，26（3）：354－357.

［3］蔣力，何勇，蔣耀光.Endostar對腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長及功能的抑制作用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2009，13（21）：2069－2072.

［4］Capillo M，Mancuso P，Gobbi A，et al.Continuous infusion of endostatin inhibits differentiation，mobilization，and clonogenic potential of endothelial cell progen－itors［J］.Clin Cancer Res，2003，9（1）：377－382.

［5］蔣力，何勇，蔣耀光，腫瘤源性血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及其細胞生物學特性鑒定［J］.重慶醫(yī)學，2009，38（24）：3102－3105.

［6］Wang J M，Ku mar S，Pye D，et al.A monoclonal antibody detects heterogeneity in vascular end othelium of tumors and normal tissues［J］.Int J Cancer，1993，54（3）：363－366.

［7］孟建波，王金鎧，張金巧，等，三氧化二砷對人臍靜脈內(nèi)皮細胞作用的研究［J］.河北醫(yī)藥，2008，30（3）：288－290.

［8］陳璽，肖延風，劉陜西，等.三氧化二砷對血管內(nèi)皮細胞增殖和周期的影響［J］.陜西醫(yī)學雜志，2008，37（6）：651－653.

［9］高明，王雪雯.不同濃度的As2O3對肝癌細胞生長及VEGF表達的影響［J］.農(nóng)墾醫(yī)學，2008，30（1）：7－9.

［10］崔永安，秦叔逵，陳惠英，等，三氧化二砷對肝癌誘導血管內(nèi)皮細胞相關基因蛋白表達的影響［J］.世界華人消化雜志，2005，13（9）：1142－1144.

Arsenic Trioxide Impacted on Tumor Vascular Endothelial Cell Proliferation，Migration，Angiogenesis and Apoptosis

FU Wenda，WANG Xuewen，ZHANG Jianhua
（Medical College，Shihezi University／Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Echnic Diseases，Shihezi 832002，China）

To study the mechanism of arsenic trioxide（As2O3）on tumor vascular endothelial cell proliferation，migration，angiogenesis and apoptosis，the cells differentiated into tumor－derived endothelial cells（Td－ECs）by co－culturing with supernatants of Hep G2 cells，the anti－effect of As2O3on Td－ECs and HUVEC was detected with cell migration，flow cytometry，blood vessel formation assay.The results showed t hat As2O3effected on Td－EC in vitro promote apoptosis，and inhibited their migration and blood vessel formation，was more significant than under the same conditions over HUVEC.Conclusion is that As2O3in vitro specifically inhibit Td－EC proliferation，migration，angiogenesis and pro mote apoptosis.

As2O3；tumor－derived endothelial cells；apoptosis；migration；angiogenesis

R735.7

A

1007－7383（2011）05－0598－05

2011－05－06

國家自然科學基金項目（81060174）

傅文達（1978－），男，碩士生，專業(yè)方向為抗肝癌血管新生；e－mail：f uwenda＿1117＠sina.com。

王雪雯（1962－），女，教授，從事腫瘤血管病理生理學研究；e－mail：263＠shzu.edu.cn。