仔豬水腫病大腸桿菌的分離鑒定及其毒力基因的檢測(cè)

張少峰，候 博，王 東，周 霞

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

仔豬水腫病大腸桿菌的分離鑒定及其毒力基因的檢測(cè)

張少峰，候 博，王 東，周 霞

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

為了確定新疆石河子地區(qū)部分豬場(chǎng)斷奶仔豬發(fā)病及死亡原因，本研究以疑似仔豬水腫病的病料為研究對(duì)象，從中分離得到3株細(xì)菌，通過形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)特性、生化特性等觀察確定為大腸桿菌。3株分離菌血清型均為O139，且均能使人工感染小鼠死亡。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離株對(duì)部分抗生素有不同程度的耐藥性。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3株菌均攜帶黏附素（Fed A）和類志賀毒素（SLT－2e）基因。由此可以確定可離的3株細(xì)菌是本次仔豬感染死亡的病原。

仔豬水腫?。淮竽c桿菌；毒力基因

仔豬水腫病是由產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）引起的斷奶仔豬的一種急性傳染?。?］。該病首先報(bào)道的時(shí)間是1938年，隨后許多國(guó)家均有發(fā)病報(bào)道［2－3］。仔豬水腫病發(fā)病急、死亡快，而且多發(fā)于生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)好、外觀健康肥壯、斷乳后1－2周的仔豬。具體表現(xiàn)為胃壁、臉部、眼瞼、結(jié)膜等處皮下水腫，發(fā)病仔豬四肢麻痹，步態(tài)蹣跚，痙攣和昏迷等癥狀。發(fā)病率為10%～30%，但病死率高達(dá)80%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害［4］。仔豬水腫病的發(fā)生除了與飼養(yǎng)管理及豬的免疫狀態(tài)發(fā)生改變等有關(guān)外，某些毒力因子也發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，如類志賀氏毒素（SLT－2e）、大腸桿菌的黏附素（Fed A）［5］以及某些腸毒素（熱穩(wěn)定性腸毒素ST1和熱不穩(wěn)定性腸毒素LT1）［4］等。

筆者從新疆石河子地區(qū)部分豬場(chǎng)疑似仔豬水腫病的豬場(chǎng)病例中先后分離到3株細(xì)菌，通過形態(tài)特性、培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)鑒定以及動(dòng)物試驗(yàn)等一系列方法和手段進(jìn)行鑒定，同時(shí)采用PCR技術(shù)對(duì)主要毒力因子基因SLT－2e、Fed A、ST1及LT1進(jìn)行檢測(cè)，以期為該病的有效防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

病料來自于2008年10－11月新疆石河子地區(qū)部分豬場(chǎng)疑似仔豬水腫病病例。采集部位為胃大彎水腫液、胃小彎水腫液、胃淋巴結(jié)、腸系膜病變淋巴結(jié)。

1.1.2 主要試劑

麥康凱、甲基紅、維培、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽等試驗(yàn)用培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［6］配制。Taq DNA聚合酶、d NTP和GM－335 mar k均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)小鼠由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌的分離 無菌采取病料接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，挑取紅色中等大小光滑菌落，接種于普通肉湯增菌，再劃線于麥康凱瓊脂平板上，挑取單個(gè)菌落涂片、染色、鏡檢。

1.2.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性觀察 將分離菌接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂、鮮血瓊脂平板、普通肉湯等培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)特性。

1.2.1.3 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 挑取單個(gè)菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.1.4 生化特性觀察 將所分離的細(xì)菌分別接種于不同的培養(yǎng)基，分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅和維培試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)。

1.2.2 血清型鑒定

將從疑似仔豬水腫病病例中分離得到的大腸桿菌菌株由中國(guó)獸藥監(jiān)察所進(jìn)行大腸桿菌血清型的鑒定。

1.2.3 小鼠人工感染試驗(yàn)

將所分離的細(xì)菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)。每株細(xì)菌腹腔注射5只小鼠（3×108CFU／mL），對(duì)照組注射等體積的無菌肉湯。注射后的小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及死亡情況。死亡的立即剖檢，無菌采取肝臟、脾臟、心血，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。同時(shí)觀察其病理變化。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

按K－B紙片法操作及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定?？股匕敲顾?、鏈霉素、慶大霉素、青霉素G、諾氟沙星、復(fù)方新諾敏、頭孢氨芐、四環(huán)素藥敏紙片。

1.2.5 毒力基因擴(kuò)增

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank中公布的大腸桿菌的SLT－2e、Fed A、ST1及LT1基因的堿基序列，參照文獻(xiàn)［7］分別設(shè)計(jì)了上游引物P1和下游引物P2。引物由上海生物工程公司合成。引物序列見表1。

1.2.5.2 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)采用20μL體系，終濃度為40 mmol／L上下游引物各1.0μL，DNTP（2 mmol／L）1.0μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液1.0μL，Mg（25 mmol）1.6μL，DNA 模板1.0 μL，Taq酶2.0μL最后加雙蒸水到20μL。反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［8］中的方法進(jìn)行。離到3株菌，分別命名為SM1、SM2和SM7。顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察，分離菌為中等大小的革蘭氏陰性桿菌，兩端略圓，多數(shù)單個(gè)存在，也有成雙或聚集成團(tuán)。

表1 毒力基因的PCR擴(kuò)增引物Tab.1 The primers of virulence gene amplified with PCR

2.2 培養(yǎng)特性

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離及形態(tài)特點(diǎn)

從發(fā)病豬胃大彎水腫液和胃、腸淋巴結(jié)中共分

將分離的細(xì)菌接種于普通肉湯，37℃恒溫培養(yǎng)24 h時(shí)，肉湯均勻渾濁，可見管壁有沉淀環(huán)，管底有灰白色沉淀。在鮮血平板上培養(yǎng)后可見3株菌均產(chǎn)生明顯的β溶血。在麥康凱瓊脂平板上形成中等大小、圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的紅色小菌落。在普通瓊脂平板上長(zhǎng)成圓形、表面光滑、邊緣整齊、灰白色、半透明的中等大小菌落。在巧克力瓊脂平板形成中等大小、圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的白色菌落。

2.3 三株細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果

通過與腸桿菌科細(xì)菌生化特點(diǎn)表進(jìn)行對(duì)照，均符合大腸桿菌埃希菌屬的生化特征（表2）。

表2 三株細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果Tab.2 The results biochemical characteristics of 3 isolates

2.4 血清型鑒定結(jié)果

SM1、SM2和SM7 3株大腸桿菌血清型均為O139。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3株細(xì)菌均對(duì)頭孢氨芐、慶大霉素、諾氟沙星、復(fù)方新諾敏敏感；對(duì)青霉素G、鏈霉素耐藥；其中SM2菌對(duì)卡那霉素耐藥，但對(duì)四環(huán)素敏感；SM1和SM7菌對(duì)卡那霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素中度敏感。

2.6 小鼠人工感染試驗(yàn)結(jié)果

腹腔注射肉湯培養(yǎng)物12 h后，試驗(yàn)組小鼠開始發(fā)病死亡，48 h后全部死亡。小鼠在死亡前四肢呈游泳狀，并伴發(fā)有共濟(jì)失調(diào)的神經(jīng)癥狀。

剖檢死亡小鼠可見肝臟、脾臟、腎臟表面有明顯的出血點(diǎn)，胃大彎和小腸有明顯的水腫，并有膠凍樣物質(zhì)，尤其在十二指腸和回腸段比較明顯（圖1）。

無菌采取心血、肝臟、脾臟、腎臟分別接種于無菌肉湯，培養(yǎng)18 h后涂片、鏡檢，可以看到革蘭氏陰性桿菌，通過生化鑒定后確定為被接種大腸桿菌，對(duì)照組小鼠未見異常。

圖2 Fed A基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR Products of Fed A gene

圖1 人工感染小鼠部分眼觀病理變化Fig.1 Some pathological changes in infected mice

2.7 毒力因子擴(kuò)增

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，結(jié)果（圖2、圖3和表3）顯示：在SM1、SM2、SM7株菌中均擴(kuò)增出了與Fed A預(yù)計(jì)大小一致的510 bp的片段；3株細(xì)菌也擴(kuò)增到與SLT－2e預(yù)計(jì)大小基本一致的230 bp片段；3株菌均未擴(kuò)增出LT1和ST1基因。

圖3 SLT－2e基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR Products of Fed A gene

表3 毒力基因擴(kuò)增結(jié)果Tab.3 The results of virulence genes amplified

3 討論

3.1 大腸桿菌埃希菌屬是革蘭氏陰性桿菌

存在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的菌群多為正常菌群，但少數(shù)具有致病性特殊血清型的菌群，會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大損失。有研究表明致仔豬水腫病主要的血清型有 O139、O138、O141、O45、O8［9］。這次所分離的細(xì)菌屬于O1393株細(xì)菌血清型均為O139，與Oanh等［3］等報(bào)道的46株菌中有21株為血清O139的結(jié)果一致。分離的菌株出現(xiàn)了β溶血現(xiàn)象，同時(shí)小鼠人工感染后全部死亡，均符合致病性大腸桿菌的特性。

研究表明，母源抗體下降，飼料中的蛋白質(zhì)含量過高，粗纖維不足，飼料成分急劇改變，過飽、缺硒、氣候改變及個(gè)體易感性等均與此病有關(guān)。同時(shí)人們發(fā)現(xiàn)SLT－2e是引起水腫病發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì)。因此還有人利用SLT－2e B亞基決定特異性的特點(diǎn)制備單克隆抗體，開展了豬水腫病特異性診斷方法的研究［10］。而F18菌毛有助于大腸桿菌粘附在腸上皮細(xì)胞上。F18菌毛主要亞單位Fed A編碼170個(gè)氨基酸，可黏附于小腸粘膜上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在小腸的定居［11］。SLT－2e是一種血管毒素，可改變血管的通透性，導(dǎo)致水腫病的發(fā)生［5，12］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，分離得到的3株致仔豬水腫病的大腸桿菌可導(dǎo)致全部試驗(yàn)小鼠死亡，且小鼠胃大彎和小腸出現(xiàn)明顯的水腫，尤其在十二指腸和回腸水腫明顯。毒力因子基因檢測(cè)結(jié)果表明，該大腸桿菌攜帶有SLT－2e和粘附性菌毛基因Fed A，而LT 1、ST1均為陰性。因此，此次分離鑒定的結(jié)果顯示，石河子地區(qū)流行菌株致豬水腫病的主要致病因子為SLT－2e及F18，O139為優(yōu)勢(shì)血清型。這與文獻(xiàn)［7］的報(bào)道相似。

3.2 致病性的大腸桿菌具有天然耐藥性和獲得性耐藥性的特性

大腸桿菌的耐藥性已成為獸醫(yī)臨床治療大腸桿菌病最為棘手的問題之一［13］。從本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，分離株對(duì)部分抗生素有不同程度的耐藥性，且具有多重耐藥的特點(diǎn)。因而，規(guī)?；i場(chǎng)應(yīng)該建立細(xì)菌耐藥性檢測(cè)制度，根據(jù)藥敏的動(dòng)態(tài)變化情況隨時(shí)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，采用聯(lián)合用藥、交叉用藥等方法盡可能避免新的耐藥菌株的產(chǎn)生。由于仔豬水腫病病程短，死亡迅速，往往同窩生長(zhǎng)快且膘情好的仔豬在尚未出現(xiàn)任何癥狀時(shí)會(huì)突然死亡，這給該病的治療帶來了極大困難。因此，除了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，應(yīng)更加重視疫苗的免疫預(yù)防在仔豬水腫病中的作用。由于大腸桿菌有眾多血清型，建議各豬場(chǎng)應(yīng)該根據(jù)其自身大腸桿菌的流行情況和主要血清型制備疫苗，才能有效控制水腫病的發(fā)生。

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Identification of Escherichia coli Inducing Edema Disease of Pig and Detection of Virulence Genes

ZHANG Shaofeng，HOU Bo，WANG Dong，ZHOU Xia
（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Three bacteria were isolated fro m edema disease in piglets in so me far ms fr om Shihezi，Xinjiang.Those isolates were comfirmerd to be E.coli through morphological characteristic，culture characteristic，biochemical characteristic.They were serotype O139 and caused the death of mice in artificial experiment.The results of drug sensitivity test indicated that the 3 isolates had resistance to some antibiotic in varying degrees.The 3 isolates had virulence genes of Fed A and SLT－2e with PCR.The 3 isolates were pathogen inducing edema disease of piglets.

edema disease of swine；Escherichia coli.；virulence gene

S858.315.1

A

1007－7383（2011）05－0579－04

2011－01－29

人力資源和社會(huì)保障部留學(xué)回國(guó)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目（2010LX007）

張少峰（1986－），男，本科生，獸醫(yī)專業(yè)。

周霞（1968－），女，副教授，從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)的研究；email：zhouxia0993＠yahoo.com.cn。