幾株益生乳桿菌耐藥性的研究

梁萌萌,張柏林,趙紫華,韓俊華

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

幾株益生乳桿菌耐藥性的研究

梁萌萌1,張柏林2,趙紫華1,韓俊華1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

采用藥敏紙片法研究了戊糖乳桿菌、瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌等7株益生乳桿菌對11種抗生素的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),7株乳桿菌均耐受多種抗生素。對戊糖乳桿菌LP-B耐四環(huán)素基因(tetM,tetS和tetW)的初步研究表明,該四環(huán)素耐受基因不位于基因組DNA上,是否存在于質(zhì)粒上及其該基因的轉(zhuǎn)移性等尚有待于進(jìn)一步研究。

益生菌;乳桿菌;耐藥性

乳酸菌是一大類能發(fā)酵葡萄糖(或其他可利用的碳水化合物)產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌。它們大多是來源于人或動(dòng)物腸道的正常菌群,包括乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等多個(gè)菌屬,是迄今為止廣泛使用的一類益生菌,在醫(yī)藥保健、食品、飼料等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

傳統(tǒng)的乳酸菌菌種,如嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在安全應(yīng)用上已有很長的歷史,被認(rèn)為是沒有致病可能性的微生物。目前新的益生乳酸菌菌種不斷被開發(fā)出來進(jìn)入市場,這些新菌種是否具有傳統(tǒng)菌種的安全性,已引起國內(nèi)外專家的極大爭論。所以,重新評價(jià)它們的安全性是十分必要的。乳酸菌等益生菌的耐藥性評價(jià)是益生菌安全評價(jià)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。有研究表明,用于生產(chǎn)酸奶、保健品的乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌等具有耐藥性且攜帶耐藥基因[1-2]。一般認(rèn)為,如果沒有抗生素的廣泛使用等選擇性壓力的存在,對益生菌傳遞耐藥性的憂慮是沒有必要的。但當(dāng)抗生素濫用已成為一種嚴(yán)重的社會問題時(shí),監(jiān)測益生菌的耐藥性就顯得非常必要和迫切了。

近十年來,國外在益生菌的耐藥性方面做了大量研究工作。D’AIMMO等較系統(tǒng)地報(bào)道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關(guān)的基因,如Bif idobacterium longum抗四環(huán)素(tetracycline)的基因tetW,干酪乳桿菌(L actobacillus casei)抗四環(huán)素和紅霉素(erythromycin)的質(zhì)粒基因tetM和ermB等[1]。TOOMEY等則進(jìn)一步研究報(bào)道了戊糖乳桿菌(L actobacillus plantarum)的抗四環(huán)素基因tetM在菌株間的轉(zhuǎn)移[3]。這種抗藥基因在菌種間的轉(zhuǎn)移對于人類將是很大的威脅。

目前中國還少見由益生菌引起人體感染和患病的報(bào)道,也缺乏益生菌耐藥性及人群使用后的流行病學(xué)調(diào)查資料。中國對益生菌耐藥性的研究只局限在表觀分析上,尚沒有對耐藥基因的系統(tǒng)研究報(bào)道。

本研究將對分離自食品、保健品中的幾株益生乳桿菌進(jìn)行耐藥性分析,了解菌株的耐藥性,為進(jìn)一步系統(tǒng)研究益生菌的耐藥性及安全性提供有價(jià)值的資料,也將有助于促進(jìn)益生菌安全性評價(jià)方法和安全性評價(jià)體系的建立,促進(jìn)中國益生菌市場的健康發(fā)展,使益生菌更好地為人們的健康服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用菌種如下,1)戊糖乳桿菌:Ind-1,Ind-3,LP-B,P;2)干酪乳桿菌:D-400;3)瑞士乳桿菌:L H-9,LLB。以上菌種來自北京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系,均為冷凍干燥菌種。

所用培養(yǎng)基如下:脫脂乳培養(yǎng)基(每100 mL分別加入脫脂奶粉14.0 g、葡萄糖1.5 g、酵母膏0.5 g)、MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 藥敏紙片

抗生素藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司,每片直徑為 6.5 mm;哌拉西林(100μg/片),慶大霉素(10μg/片),紅霉素(15μg/片),四環(huán)素(30μg/片),萬古霉素 (30μg/片),氯霉素(30μg/片),青霉素G(10IU/片),環(huán)丙沙星(5μg/片),頭孢噻吩(30μg/片),鏈霉素(10μg/片),利福平(5μg/片);質(zhì)量完全符合 WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

1.3 儀器和試劑

儀器:血球計(jì)數(shù)板、XPX-250B-Ⅱ生化培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、分析天平、顯微鏡、高壓滅菌鍋等。

試劑:無水乙醇、氯化鈉、酵母膏、脫脂奶粉等。

1.4 菌種活化

將一定量的冷凍干燥菌種在滅菌的0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的生理鹽水中復(fù)水,在脫脂乳培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中逐級活化,待活力恢復(fù)后,再以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基,于37℃恒溫培養(yǎng)10 h,作為試驗(yàn)菌種備用。

1.5 藥敏紙片法測定菌種耐藥性

1.5.1 接種、藥敏紙片貼放及培養(yǎng)

吸取試驗(yàn)菌菌液1 mL(約1.5×108cfu/mL)于直徑90 mm滅菌培養(yǎng)皿中,傾倒約15 mL的MRS瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待培養(yǎng)基凝固后,在室溫下干燥5 min。用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面,各紙片中心相距大于24 mm,紙片距平板內(nèi)緣大于15 mm,每皿貼放3片。室溫放置1.5 h,然后置于37℃培養(yǎng),24 h后用精確度1 mm的游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈直徑。每種抗生素均設(shè)3個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值。

以標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923(Staphylococcus aureusATCC 25923)為質(zhì)控菌 ,操作同上。

1.5.2 受試菌對抗生素的敏感性判斷

受試菌株對多種抗生素的藥敏性參照 WHO提供的NCCLS最新標(biāo)準(zhǔn)(見表1)進(jìn)行判斷,報(bào)告該受試菌對該抗生素是敏感(susceptible,用S表示),耐藥(resistant,用R表示),還是中度敏感(intermediate,用 I表示)。

表1 試驗(yàn)用藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Antibiotic susceptibility test discs and criterion for inhibitory result

1.6 抗藥基因的檢測

乳桿菌基因組DNA的提取參照 GIRAFFA等人的方法[4]進(jìn)行。

以tetM,tetS和tetW為引物,通過PCR基因擴(kuò)增檢測戊糖乳桿菌LP-B對四環(huán)素的抗藥性。引物由北京華大基因公司合成,其序列及相關(guān) 信息見表2。

表2 檢測四環(huán)素抗性基因的引物Tab.2 Primers used for PCR detection of tetracycline resistance genes

以戊糖乳桿菌LP-B的基因組DNA為模板,PCR反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性1 min,52～54℃退火30～60 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min[7]。反應(yīng)結(jié)束后取1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳(100 V,4℃),經(jīng)染色,紫外燈下觀察并照相記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的耐藥性

將貼放藥敏紙片后培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)皿取出,測量各培養(yǎng)皿中藥敏紙片產(chǎn)生的抑菌圈的大小。結(jié)合表1的判斷標(biāo)準(zhǔn)得出藥敏性結(jié)果,見表3。

表3 7種受試菌對11種抗生素的藥敏性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Antibiotic resistance results for 7 strains tested with 11 antibiotics

由表3可見,4株戊糖乳桿菌有相似的耐藥譜,只是對于哌拉西林、頭孢噻吩、氯霉素、四環(huán)素、利福平有差異。Ind-3對上述4種抗生素有耐藥性,其他3株菌沒有耐藥性。

2株瑞士乳桿菌的耐藥譜也相似,但是L H-9對四環(huán)素中度敏感而LLB對其有耐藥性。由以上結(jié)果可以看出同一屬的不同菌株的抗藥性也是有差異的。

所有菌株對青霉素 G、環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素耐藥,對紅霉素都不耐藥。對于哌拉西林、頭孢噻吩和氯霉素,除Ind-3耐藥外其他都不耐藥。L H-9,LLB和 Ind-3對利福平耐藥,其他不耐藥。對于四環(huán)素,除 P,LP-B,D-400和L H-9菌株外均耐藥。具有這樣耐藥性的乳酸菌進(jìn)入人體是潛在的不安全因素?？梢?建立并加強(qiáng)中國益生菌的耐藥性監(jiān)測體系,評估目前所使用的菌種的安全性,促進(jìn)食品和保健品市場的健康發(fā)展是極為必要和迫切的。

2.2 乳桿菌耐藥基因的探討

提取戊糖乳桿菌LP-B基因組 DNA后,以tetM,tetS和tetW為引物,通過 PCR擴(kuò)增檢測其四環(huán)素耐藥基因,結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見,擴(kuò)增出的條帶和表2中報(bào)道的大小不符。因此,初步認(rèn)為,戊糖乳桿菌LP-B的基因組上不存在四環(huán)素抗性基因tetM,tetS和tetW。然而由于該菌株表現(xiàn)出對四環(huán)素的抗性,因此抗性基因很可能存在于質(zhì)粒上,尚有待于后續(xù)研究。

圖1 戊糖乳桿菌LP-B基因組DNA的PCR結(jié)果Fig.1 PCR result of genomic DNA in L actobacillus pentosusLP-B

3 結(jié) 語

全球性的細(xì)菌抗生素耐藥是近年來感染性疾病治療所面臨的一大難題。隨著各種新型抗生素在臨床上的應(yīng)用,細(xì)菌的耐藥也越來越廣。目前,國際上對益生菌耐藥性的測定尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)程序。筆者參考WHO方法,選擇了抑制細(xì)菌細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)合成的11種常用抗生素。被檢測的7株益生菌均耐受3種以上的抗生素,屬于多重耐藥菌。而益生菌對人體健康影響的一個(gè)非常重要的方面就是其耐藥性,其中萬古霉素尤其受到關(guān)注。萬古霉素在臨床上通常被推薦用來治療對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌的感染,包括敗血癥、心內(nèi)膜炎、組織和骨感染,通常被認(rèn)為是抗菌藥物的最后一道防線[8]。許多乳桿菌,如羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌均具有對萬古霉素的耐藥性,被認(rèn)為是一種天然特性[9]。本研究測定的7株益生菌均表現(xiàn)出對萬古霉素的耐藥性。這些研究結(jié)果提醒人們,在將益生菌應(yīng)用于食品中時(shí)應(yīng)該謹(jǐn)慎,避免選用有耐藥性的菌種,同時(shí)在臨床上則應(yīng)該選用敏感性藥物。

明確乳酸菌的耐藥機(jī)制是十分重要的。研究發(fā)現(xiàn),羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌中存在R質(zhì)粒,它攜帶紅霉素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類林克霉素等的耐藥基因。大量與耐藥相關(guān)的基因都位于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子這些可轉(zhuǎn)移性遺傳物質(zhì)上[10]。本研究結(jié)果表明,與戊糖乳桿菌LP-B四環(huán)素耐藥性相關(guān)的tetM,tetS和tetW基因不在基因組DNA上,很可能存在于質(zhì)粒上。因此,進(jìn)一步研究其耐藥基因及其轉(zhuǎn)移性是非常必要的。而且,目前益生菌的安全性問題主要集中在由益生菌所攜帶耐藥基因轉(zhuǎn)移引起的耐藥性上。可見,益生菌菌株的耐藥性評價(jià)是目前國際上益生菌安全評價(jià)的首要內(nèi)容。

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Study on antibiotic resistance of probiotic lactobacillus

LIANG Meng-meng1,ZHANGBo-lin2,ZHAO Zi-hua1,HAN Jun-hua1
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang Hebei 050018,China;2.College of Bioscience and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

In this study,the antibiotic sensitivity of probiotic lactobacillus(L actobacillus pentosus,L actobacillus helveticusandL actobacillus casei)to 11 kinds of antibiotics is tested by antibiotic susceptibility test discs.The results show that each strain is resistant to more than 3 kinds of antibiotics.The tetM,tetS and tetW genes related to tetracycline resistance ofL actobacillus pentosusLP-B are discussed.However,the genes are not found in the genomic DNA ofL actobacillus pentosusLP-B.So the characterisation and transferability of antibiotic resistance genes is yet to be studied.

probiotics;lactobacillus;antibiotic resistance

TS201.3

A

1008-1534(2011)04-0250-04

2011-02-22;

2011-03-29

責(zé)任編輯:王海云

河北科技大學(xué)2010年度大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(10259);河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金資助項(xiàng)目(2010240);河北科技大學(xué)博士科研基金資助項(xiàng)目(000335)

梁萌萌(1987-),女,河北滄州人,主要從事食品微生物及生物技術(shù)方面的研究。

韓俊華博士。E-mail:teach2003@126.com