具有自激活切割活性腸激酶輕鏈基因設計、表達及活性研究

朱文赫,郭志剛,劉紅建,郭祥瑞,孫德軍

(1.吉林大學再生醫(yī)學科學研究所 生物技術藥物教研室,吉林 長春 130021;2.吉林大學 中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130033)

具有自激活切割活性腸激酶輕鏈基因設計、表達及活性研究

朱文赫1,郭志剛2,劉紅建1,郭祥瑞1,孫德軍1

(1.吉林大學再生醫(yī)學科學研究所 生物技術藥物教研室,吉林 長春 130021;2.吉林大學 中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130033)

目的 獲得 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列 +牛 EKL的 cDNA序列,實現(xiàn) EKL基因在大腸桿菌中的融合表達和自切割。方法 用 Trizol法從牛十二指腸組織中提取總 RNA,利用 RT-PCR技術擴增其 cDNA片段,將此片段克隆于表達載體 p GEX-2T,并在其前引入腸激酶 (EK)識別序列。結果 所表達蛋白經(jīng) SDS-PAGE分析,相對分子質量約為 61 000,經(jīng) GST-Sepharose親和色譜柱純化后得到單一蛋白,SDS-PAGE顯示單一條帶,用微量 EK引發(fā)自切割,切斷 GST標簽蛋白和 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用對氨基苯甲脒-Sepharose親和色譜獲得了輕鏈 EK的單體。結論 成功地克隆、表達了牛 EK輕鏈基因,采用自激活、切割獲得了 EK單體,每 1 L培養(yǎng)基獲得 EK 5 mg,為進一步進行重組牛 EK活性的研究及應用奠定了基礎。

腸激酶;大腸桿菌表達系統(tǒng);谷胱甘肽轉移酶;自激活

腸激酶 (Enterokinase,EK)是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶,EK相對分子質量 (Mr)為 150 000,由 1條 Mr115 000重鏈和 1條Mr35 000輕鏈組成。重組融合蛋白經(jīng) EK酶解所釋放的目的蛋白質 N末端氨基酸序列具有和野生型相同的一級結構[1],EK由于專一識別 5個氨基酸多肽 (D-D-D-D-K-X1)并在賴氨酸的羧基上切割,是 N末端融合通常選擇的蛋白酶,在其他殘基的不規(guī)則切割發(fā)生水平較低,這取決于蛋白質底物的構象。1個單位定義為在 23℃下切割融合蛋白 50μg在 8 h內達到 95%切割率所需的酶量,這種特點使得 EK成為基因工程融合蛋白表達后修飾過程中 1個極其有用的工具而被廣泛應用。天然EK由 1條結構亞基 (重鏈)和 1條催化弧基 (輕鏈)構成[2],兩者通過 1個分子間二硫鍵結合,結構亞基負責將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導它向腸腔移動,催化亞基可以特異性識別 A sp-Asp-A sp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下[3]。EK輕鏈結構在人、牛和豬中相對保守,其識別序列 Asp-A sp-Asp-Asp-Lys在脊椎動物中也有很強的保守性,且?guī)缀跛斜欢ㄐ虻囊鹊鞍酌冈季哂?4個天冬酰胺相連的特征,此序列在其他的天然蛋白質上又非常罕見[4],而 EK的活性中心有 1個特殊的陽離子位點,使得有強大負電的 Asp-Asp-Asp-Asp可以與此陽離子位點結合。EK輕鏈體外具有全酶酶切特異性,相對于天然 EK,表現(xiàn)出對基因工程融合蛋白質底物的酶切活性增強[5]。

天然的 EK來源非常有限,目前獲得 EK的主要方法是從豬、牛等動物的十二指腸中分離提取得到,操作步驟繁瑣,提取分離的成本高,而且天然提取的EK易為其它蛋白酶污染,在切割融合蛋白質的同時又降解了目的產(chǎn)物[6],大大影響了其商品價值。本研究中,我們設計并構建了 p GEX-EKL原核融合表達載體,為經(jīng)濟、有效切除 GST部分并獲得與天然結構一致的 EK,在 EK序列的 N端引入 EK位點,實現(xiàn) EK的切割后的自激活和切割,將其在大腸桿菌中表達,并對表達產(chǎn)物進行純化、鑒定,為進一步進行重組牛 EK活性的研究及應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質粒 牛十二指腸購于長春皓月集團 ;菌株 E.coli DH 5α(DE3)、BL21(DE3)和 p GEX-2T質粒由吉林大學生物藥物研究室保存;pMD18-T載體購于大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑 所有的限制性內切酶、T4酶、Taq DNA聚合酶、Turb RT反轉錄酶、蛋白質Marker、IPTG均購于大連寶生物工程有限公司;Trizol購于北京鼎國生物技術有限責任公司;蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖均購于 Oxiod公司。

1.2 方 法

1.2.1 EKL基因的獲得 牛十二指腸組織置于預冷的組織研磨器中研磨使其勻漿化,用 Trizol法抽提總 RNA,用反轉錄試劑盒 RT-PCR得到相應的cDNA。根據(jù) GenBank上牛 EK的全基因序列設計PCR引物,為了便于表達載體的構建,引入了 Bam HⅠ和 Eco RⅠ的酶切位點:T1(5′-CGGGATCCCCACCATGGAUGAUGAUGAUAAGATTGTCGGAGGAAG)和T2(3′-CCGGAATTCTACATCTTTTGAAACATAGGTGAGAC)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用 Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit(TaKaRa)膠回收試劑盒回收。

1.2.2 EKL原核表達質粒的構建 將 PCR獲得的EKL基因片段連接到 pMD18-T載體上并轉化E.coli BL21,涂布于含有氨芐青霉素 (Amp)的瓊脂板上,挑取陽性克隆并進行菌落 PCR鑒定和酶切鑒定。將經(jīng)過 E.coli BL21克隆擴增的 pMD18-EKL和原核表達載體 p GEX-2T用 Bam HⅠ、Eco RⅠ雙酶切,產(chǎn)物回收后用 T4-DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉化E.coli DH 5α感受態(tài)細胞,用 Bam HⅠ、Eco RⅠ雙酶切鑒定質粒,酶切正確的質粒經(jīng)由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.3 融合蛋白質 GST-EKL的誘導表達 在p GEX-2T表達系統(tǒng)中融合蛋白質的表達受Lac啟動子的調控,需要 IPTG進行誘導。挑選轉化了 p GEX-rEKL的單克隆接種于含 Amp(100μg/mL)的 2×YT液體培養(yǎng)基 100 mL中,200 r/min 37℃培養(yǎng)至A600為 0.8左右,加入 IPTG至終濃度 0.8 mmol/L,在 25℃培養(yǎng) 3 h。

1.2.4 融合蛋白質 GST-EKL的純化 將誘導表達的重組菌 4℃,6 000 r/min離心 20 min收集菌體,按每 1 mL培養(yǎng)物用去離子水 25μL重懸菌體,加入溶菌酶至終濃度 100μg/mL,室溫放置 15 min。然后按每 1 mL培養(yǎng)物加入預冷的 pH 7.4,0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液 (PBS)25μL,按破碎體積選擇合適的超聲波探頭,進行超聲破碎。破碎后加入 20%Triton X-100至終濃度為 1%,混勻,放置 30 min,12 000 r/min離心 10 min,獲得超聲破碎的上清和包涵體沉淀。將包涵體依次置于洗滌緩沖液 (0.02 mol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,1%Triton X-100,pH 7.5)、破菌緩沖液 (0.02 mol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,pH 7.5)、變性緩沖液 (0.02 mol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,8 mol/L尿素,0.1 mol/Lβ-巰基乙醇,pH 7.5)中進行溶解,4℃透析至尿素終濃度為 0.1 mol/L,離心后上清液與超聲破碎后的上清合并后與谷胱甘肽 Sepharose 4B柱結合,依次用PBS和谷胱甘肽洗脫液洗 3次,收集洗液進行 SDSPAGE分析。

1.2.5 融合蛋白質 GST-EKL的酶切 將含有融合蛋白質的谷胱甘肽洗脫液透析除鹽后,進行 EK切割,按每 100 mg融合蛋白質加 EK 0.1μg,23℃酶切過夜,然后取樣進行 SDS-PAGE檢測,反應后的體系通過對氨基苯甲脒-Sepharose 4B凝膠柱,含 0.5 mol/L NaCl的 Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)洗脫 ,收集洗脫峰,即為重組 EK。

1.2.6 重組 EK的活性檢測 將純化后的重組 EK對重組融合蛋白質 GST-金黃色葡萄球菌蛋白 A進行酶切,重組 EK與融合蛋白質的比例分 1∶100,23℃酶切過夜,然后取樣進行 SDS-PAGE檢測。

2 結 果

2.1 EKL DNA片段的 PCR擴增及原核表達質粒的構建

用 RT-PCR擴增獲得大小約 700 bp的目的片段 (圖 1),將片段純化酶切后克隆于經(jīng)同樣酶切的p GEX-2T載體上,用 Bam HⅠ、Eco RⅠ雙酶切鑒定,片段大小正確 (圖 2)。

圖1 EKL DNA片段的 RT-PCR擴增Fig.1 The amplified EKL fragment by RT-PCR

圖2 重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by digestion with Bam HⅠ and Eco RⅠ

2.2 融合蛋白質 GST-EKL的誘導表達

表達質粒 p GEX-rEKL轉化 E.coli BL21,37℃搖菌培養(yǎng)至菌 A600為 0.8左右,用終濃度為 0.8 mmol/L的 IPTG,25℃誘導表達 3 h。SDS-PAGE結果表明在Mr約 61 000處有特異表達條帶,大小與推測的目的融合蛋白質 Mr大小相符合 (圖 3)。發(fā)酵后的菌體經(jīng)過超聲破碎后分別取菌液上清、菌體、破碎上清和破碎沉淀做 SDS-PAGE,結果顯示目的蛋白質為胞內表達,部分形成包涵體,部分以可溶形式存在 (圖 4)。

圖3 融合蛋白質 GST-EKL的誘導表達分析Fig.3 SDS-PAGE analysisof induced GST-EKL expression

圖4 超聲破碎后融合蛋白質 GST-EKL的定位分析Fig.4 GST-EKL location analysis after hypersound breaking

2.3 融合蛋白 GST-EKL的純化

將包涵體用尿素溶解后進行 SDS-PAGE檢測結果顯示包涵體中的蛋白質成功地被溶解純化 (圖5)。將含有融合蛋白質的清液通過 GST-Sepharose親和色譜純化后進行 SDS-PAGE檢測結果顯示融合蛋白質被成功純化,洗脫峰呈現(xiàn)單一條帶,Mr約為61 000(圖6)。

2.4 融合蛋白質 GST-EKL的自切割及純化

GST-Sepharose親和色譜柱純化后的 GST-EKL融合蛋白質用少量 EK切割引導,除去 GST標簽,SDS-PAGE結果顯示融合蛋白質成功被 EK切開,分為 GST標簽和輕鏈 EK兩部分 (圖 7),而切割出的EK繼續(xù)能切割體系中未完全切開的 GST-EKL融合蛋白,實現(xiàn)整個體系的自激活及切割,酶反應的混合物通過對氨基苯甲脒親和色譜柱再次純化,去除雜蛋白質,得到純品。

圖5 包涵體尿素溶解的 SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysisof IBsof GST-EKL

圖6 融合蛋白質 GST-EKL的親和色譜純化Fig.6 Purification of the fusion protein GST-EKL

圖7 融合蛋白質 GST-EKL的腸激酶引發(fā)自切割及對氨基苯甲脒親和色譜Fig.7 SDS-PAGE analysis of GST-EKL by digestion with EK and purified p roteinsof EKL

2.5 重組 EK的活性鑒定

純化后 E.coli表達的 EK濃度為 5.8 mg/mL,SDS-PAGE顯示純化后的 EK酶切效果好,在與融合蛋白質混合后,當酶與 GST-金黃色葡萄球菌蛋白 A比值為 1∶100時,目的融合蛋白質的被切割率在95%以上,結果見圖 8。圖 8出現(xiàn)了Mr26 000(谷胱甘肽硫轉酶)和 32 000兩條帶,結果表明,我們制備出了具有生物活性的 EK。

圖8 表達的腸激酶對融合蛋白質酶切的 SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE clevaging analysisof EK on fusion p rotein

3 討 論

EK是胰蛋白酶原的生理激活劑,EK在體內激活胰蛋白酶原轉化為胰蛋白酶,而胰蛋白酶是消化系統(tǒng)其它許多酶原的激活劑,因此 EK被認為是消化系統(tǒng)重要的起始酶之一[7]。一般認為 EK存在于小腸刷狀緣細胞膜上,病理研究發(fā)現(xiàn),十二指腸與胰腺的回流液中富集 EK會激活過多的胰蛋白酶原從而導致急性胰腺炎,而 EK缺陷的機體將會有腹瀉、嘔吐、浮腫等癥狀,造成發(fā)育不良,導致血蛋白不足癥和貧血[8]。由于天然的 EK來源非常有限,本研究采用基因工程手段在原核表達載體中成功地表達和純化了 EK輕鏈蛋白,可以解決前人純化高成本、步驟繁瑣的不足。

載體方面,表達載體用 p GEX-2T載體,其上具有 Plac啟動子,能被乳糖類似物如 IPTG誘導,從而實現(xiàn)目的基因表達的嚴格調控和降低雜蛋白質本底,載體上帶有 Amp的抗性基因,便于對重組陽性克隆菌的篩選,而且載體還自帶 GST-tag,由于谷胱甘肽轉移酶能夠增加外源蛋白質的可溶性表達,所以我們將目的蛋白質構建在 GST標簽蛋白下游來增加 EK的可溶性,同時帶有 GST標簽的融合蛋白質能通過 GST-Sepharose親和色譜柱洗脫得到,我們已成功地應用該表達載體表達了多種生物活性蛋白[9-10]。

本研究成功的將 EK序列的 N末端引入 EK切割位點,表達了 EK輕鏈,在表達了 GST融合蛋白的同時,實現(xiàn)用少量 EK引發(fā)切割融合蛋白反應,致使EK產(chǎn)生與切割瀑布式放大,最終使整個體系完成自切割,可以得到具有天然 N末端氨基酸序列的 EK,由于 EK屬絲氨酸蛋白酶,所以選擇對氨基苯甲脒親和色譜柱,除去雜質蛋白,得到高純度的 EK蛋白,每 1 L培養(yǎng)基獲得 EK約為 5.0 mg,簡化了下游純化工藝的難度,便于擴大化生產(chǎn),促進了 EK在生物工程等領域的應用。

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Clone and expression of bovine recombinant enterokinase catalytic subun it in Escherichia coli,self-activation cutting and assement assessm en t of b ioactivity

ZHU Wen-he1,GUO Zhi-gang2,LIU Hong-jian1,GUO Xiang-rui1,SUN De-jun1
(1.Department of Biomedicine,Institute of Frontier Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Orthopaedics,China-Japan Union Hospital of Jinlin,Jilin University,Changchun 130033,China)

Purpose The sequence of bovine EKL gene with Asp-A sp-Asp-A sp-Lys sequence in the N-terminus was obtained and analyzed,and the fusion protein of the EKL-GST was produced in E.coli.Methods The fragment of bovine enterokinase light chain cDNA was obtained by RT-PCR from bovine′s duodenal mucosa,then cloned into the pMD18-T cloning vector and sequenced.Compared with the sequence deposited in GenBank,the cloned gene sequence is correct.Then the interested gene fragment was inserted into the pGEX-2T expression plasmid.The recombinant vector pGEX-rEKL was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG.Results SDS-PAGE analysis indicated that the target product was about 61 kDa.The research successfully clones and expresses EKL-GST fusion protein in E.coli.Selt-activation by microamount cutting the fusion protein,and purified the EKL by minobenzene-Sepharose.Conclusion This investigation would be able to lay a foundation for enterokinase activity research and further application of expression products on a large scale.

enterokinase;Escherichia coli;expression system;GST self-activation

Q78

A

1005-1678(2011)01-0006-05

2010-01-28

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20060564)

朱文赫,男,博士研究生;孫德軍,通信作者,Tel:0431-85619233,E-mail:sundjjl@yahoo.com.cn。