SB203580對(duì)小鼠造血組織輻射損傷的保護(hù)作用

翟志斌，王月英，張 恒，吳紅英，李德冠，路 璐，常建輝，王小春，孟愛(ài)民

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市分子和醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

SB203580對(duì)小鼠造血組織輻射損傷的保護(hù)作用

翟志斌，王月英，張 恒，吳紅英，李德冠，路 璐，常建輝，王小春，孟愛(ài)民

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市分子和醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

目的 觀察SB203580對(duì)接受γ射線照射的C57BL/6小鼠造血組織損傷的保護(hù)作用。方法 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(Ctr)組、照射(IR)組及SB203580給藥(SB)組，以6.0 Gy137Csγ射線全身均勻照射SB組和IR組的C57BL/6小鼠。收集并計(jì)數(shù)外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，以及單側(cè)股骨骨髓有核細(xì)胞(BMMNC);骨髓細(xì)胞半固體培養(yǎng)法檢測(cè)BMMNC增殖能力。另外收集小鼠BMMNC，同樣分組，IR組與SB組細(xì)胞進(jìn)行1 Gy體外照射，照射之后孵育過(guò)夜，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果 SB組外周血白細(xì)胞、血小板的數(shù)量分別比IR組高111.8%和157.7%(P ＜0.05);SB 組 BMMNC 較 IR 組高135.4%，CFU-GM 高188.5%(P ＜0.05);SB 組 BMMNC內(nèi)ROS較IR組低56.2%(P＜0.05)。結(jié)論 SB203580對(duì)照射造成的小鼠造血組織損傷具有一定的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與其降低照射后細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。

SB203580;骨髓有核細(xì)胞;單核-粒細(xì)胞集落形成單位;活性氧

造血組織是一類輻射敏感組織，電離輻射造成造血組織損傷可導(dǎo)致貧血、出血和免疫力降低，是核輻射事故與放射治療中患者死亡的主要原因之一。電離輻射可使DNA造成損傷，同時(shí)激活應(yīng)激通路。p38 MAPK是重要的應(yīng)激通路蛋白。電離輻射可能通過(guò)作用于機(jī)體產(chǎn)生的活性氧(ROS)激活 p38 MAPK，導(dǎo)致組織損傷［1］。本文選擇p38MAPK的特異性抑制劑SB203580，通過(guò)外周血細(xì)胞與骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及集落形成實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)于血液系統(tǒng)的保護(hù)作用，另外，通過(guò) ROS實(shí)驗(yàn)初步探討SB20358對(duì)造血組織起到保護(hù)作用的機(jī)制，為研發(fā)相關(guān)輻射防護(hù)劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

SB203580購(gòu)自LC Laboratories;ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;甲基纖維素培養(yǎng)基購(gòu)自Stemcell Technology有限公司;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津美德太平洋有限公司。

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，體重20～22 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào):SCXK(京)2002-0003。

日本sysmex poch-100i全自動(dòng)血液分析儀;瑞士TECAN公司infinite2000多功能酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 照射條件

137Csγ射線進(jìn)行一次性全身6.0 Gy照射(輻射源購(gòu)自加拿大原子能有限公司)，劑量率為0.88 Gy/min;體外照射股骨骨髓有核細(xì)胞(BMMNC)，照射劑量為 1 Gy，劑量率為 0.76 Gy/min。

2.2 分組及給藥

將C57BL/6小鼠分為對(duì)照(Ctr)組、照射(IR)組和SB203580給藥(SB)組，每組10只。對(duì)照組接受假照射，其余2組進(jìn)行劑量為6.0 Gy的γ射線一次性全身照射。SB組于照射前30 min腹腔注射SB203580 15 mg/kg，照射后24 h繼續(xù)給藥，隔日1次，共5次，Ctr組和IR組給予等體積二甲亞砜(DMSO)。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

2.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 末次給藥24 h后，眼靜脈叢取血，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。另取小鼠一側(cè)股骨，2 mL注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液1 mL沖洗股骨，得到骨髓細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)BMMNC。

2.3.2 單核-粒細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM) 末次給藥24 h后，取雙側(cè)股骨，用注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液沖洗，收集骨髓細(xì)胞。計(jì)數(shù)后加入甲基纖維素培養(yǎng)基中，接種至24孔板內(nèi)。于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)6 d。于第6天，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性集落(細(xì)胞數(shù)＞30的細(xì)胞集落為陽(yáng)性集落)。結(jié)果以每105細(xì)胞形成的陽(yáng)性集落數(shù)來(lái)表示。

2.3.3 ROS 另取正常C57BL/6雄性小鼠6只，處死后取雙側(cè)股骨，用注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液沖洗，收集骨髓細(xì)胞。骨髓細(xì)胞經(jīng)Ficoll密度梯度離心得到BMMNC，將細(xì)胞分為Ctr組、IR組和SB組，每組含1×106細(xì)胞，其中IR組和SB組接受1 Gyγ射線照射，SB組在照射前在37℃、5%CO2，含 1μmol/L SB203580的培養(yǎng)基內(nèi)孵育30 min，Ctr組與IR組接受與SB組等量的DMSO。接受照射之后各組細(xì)胞接種至24孔板，在37℃、5%CO2，飽和濕度的條件下過(guò)夜。樣本處理依照檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明，多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm的條件下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度。DCF熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 SB203580緩解電離輻射導(dǎo)致的血液細(xì)胞數(shù)目下降

結(jié)果見表1。6 Gy一次性全身照射的小鼠(IR組)外周血紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板較Ctr組分別低29.9%，97.1%和 95.4%(P ＜0.01);經(jīng)SB203580干預(yù)之后(SB 組)，RBC、WBC、血小板較 Ctr組分別低 29.9%，93.9% 和 88.0%(P ＜0.01)，與 IR 組比較，WBC 高 111.8%(P ＜0.05)，血小板高157.7%(P ＜0.01)。

3.2 SB203580對(duì)骨髓有核細(xì)胞的保護(hù)作用

結(jié)果見表1。6 Gy一次性全身照射的小鼠(IR組)BMMNC 較 Ctr組低80.9%(P ＜0.01);CFU-GM較 Ctr組低 95.7%(P ＜0.01);給予 SB203580 后(SB 組)，BMMNC 比 Ctr組低86.2%(P ＜0.01)，比IR組高 135.4%(P ＜0.01)，CFU-GM 比 Ctr組低55.0%(P ＜0.01)，比 IR 組高 188.5%(P ＜0.05)。說(shuō)明SB203580可以抑制小鼠全身照射后引起的造血功能下降。

3.3 SB203580的抗氧化作用

ROS的測(cè)定結(jié)果見表1。經(jīng)1 Gyγ射線照射后，IR組BMMNC內(nèi) ROS較 Ctr組高69.5%(P＜0.05);SB組BMMNC內(nèi)ROS產(chǎn)生較IR組低56.2%(P ＜0.05)。

表1 SB203580預(yù)防給藥對(duì)小鼠全身照射血液系統(tǒng)的保護(hù)作用( s，n=10)Tab.1 The effects of SB203580 on blood system in C57 mice with irradiation(，n=10)

表1 SB203580預(yù)防給藥對(duì)小鼠全身照射血液系統(tǒng)的保護(hù)作用( s，n=10)Tab.1 The effects of SB203580 on blood system in C57 mice with irradiation(，n=10)

與 Ctr組比較:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01; 與 IR 組比較:3 P ＜0.05，4 P ＜0.01Compared with Ctr group:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01;Compared with IR group:3 P ＜0.05，4 P ＜0.01

?

4 討論

受到放射損傷后的機(jī)體大多會(huì)出現(xiàn)貧血、感染和出血等癥狀，并且，外周血RBC、WBC、血小板數(shù)目低下。外周血細(xì)胞數(shù)目低下與造血組織損傷密切相關(guān)。損傷后血液功能和造血功能的恢復(fù)依賴于殘存的具有造血功能的BMMNC的數(shù)目和能力。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到SB203580可以緩解電離輻射導(dǎo)致的WBC和血小板數(shù)目下降，另外，SB203580可以緩解單側(cè)股骨BMMNC數(shù)目的下降，還通過(guò)反映造血祖細(xì)胞的增殖能力的CFU-GM實(shí)驗(yàn)觀察到SB203580可以緩解電離輻射導(dǎo)致的骨髓造血功能抑制。SB203580表現(xiàn)出對(duì)造血組織具有一定的輻射保護(hù)作用。

目前，盡管多項(xiàng)研究顯示p38 MAPK接到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤、阿爾茲海默病和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用［2］，SB203580可以通過(guò)抑制凋亡相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子Bax蛋白的移位，抑制缺血性心肌病引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡［3］，但SB203580對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的骨髓損傷的保護(hù)作用還鮮有報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)為期10余天，實(shí)驗(yàn)小鼠正處于輻射損傷的急性期，電離輻射所致細(xì)胞凋亡是造成造血組織損傷的主要原因。而SB203580除了可以抑制p38 MAPK活性，我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)它可以在短期內(nèi)通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。Ichijo等［1］研究顯示電離輻射產(chǎn)生的ROS可以通過(guò)激活p38 MAPK上游激酶ASK1引發(fā)細(xì)胞凋亡，我們的實(shí)驗(yàn)顯示SB203580可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而抑制凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，保護(hù)造血組織。

同時(shí)，在臨床實(shí)踐中，電離輻射對(duì)骨髓造血功能的長(zhǎng)期抑制是輻射損傷患者死亡的重要原因之一。我們的前期實(shí)驗(yàn)［4-6］發(fā)現(xiàn)caspase-3的抑制劑z-VAD可以抑制電離輻射誘導(dǎo)的造血細(xì)胞凋亡，但是對(duì)于輻射誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞增殖能力長(zhǎng)期抑制只有部分糾正，而這種長(zhǎng)期抑制由造血干細(xì)胞的永久性損傷所導(dǎo)致。Ito等［7］研究表明 ROS可以通過(guò)激活 p38 MAPK，可長(zhǎng)期抑制造血干細(xì)胞的功能，提示SB203580不僅可以抑制凋亡保護(hù)骨髓造血功能，它還可能具有緩解電離輻射導(dǎo)致的造血功能的長(zhǎng)期抑制的作用。接下來(lái)我們將會(huì)進(jìn)一步觀察SB203580對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的骨髓造血功能長(zhǎng)期抑制是否具有保護(hù)作用，并探討相關(guān)的分子機(jī)制。

［1］Ichijo H，Nishida E，Irie K，et al.Induction of apoptosis by ASK1，a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways［J］.Science，1997，275(5296):90-94.

［2］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP-kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358-1375.

［3］Capano M，Crompton M.Bax translocates to mitochondria of heart cells during simulated ischaemia:involvement of AMP-activated and p38 mitogen-activated protein kinases［J］.Biochem J，2006，395(1):57-64.

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［5］Meng A，Wang Y，Brown SA，et al.Ionizing radiation and busulfan inhibit murine bone marrow cell hematopoietic function via apoptosis-dependent and-independent mechanisms［J］.Exp Hematol，2003，31(12):1348-1356.

［6］Meng A，Wang Y，Van Zant G，et al.Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells［J］.Cancer Res，2003，63(17):5414-5419.

［7］Ito K，Hirao A，Arai F，et al.Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells［J］.Nat Med，2006，12(4):446-451.

The protective effects of SB203580 on hematopoietic tissue exposed to irradiation

ZHAI Zhi-bin，WANG Yue-ying，ZHANG Heng，WU Hong-ying，LI De-guan，LU Lu，CHANG Jian-hui，WANG Xiao-chun，MENG Ai-min
(Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine，Institute of Radiation Medicine，Peking Union Medical College，Tianjin 300192，China)

Purpose To investigate the protective effects of SB203580 on hematopoietic tissue of C57BL/6 mice injured by γ-ray.Methods Male C57BL/6 mice were randomly divided into control group(Ctr)，irradiation group(IR)and SB203580 treatment group(SB).Mice were intraperitoneal injected SB(15 mg/kg)30 minutes ahead of TBI and then given every 2 days for 5 times after the TBI.On day 11，peripheral blood count and nucleated femoral cell count were performed by blood analyzer.1 × 105cells were seeded into Methocult GF M3534 methylcellulose medium and colony-forming units-granulocyte and monocyte(CFU-GM)were scored on day 6.DCFH as a fluorescent probe assessed the reactive oxygen species(ROS)generation in overnight incubated bone marrow mononuclear cells(BMMNC)，which were irradiated at 1 Gy.Results Transitory and significant changes occurred in the cell amount of BMMNCin the irradiated mice after administration of SB203580:white blood cells，platelets and BMMNC in SB were significantly increased by 111.8%，157.7%and 135.4%(P ＜0.05).The proliferation suppression of BMMNC in IR group was eased by SB203580 injection and CFU-GM in SB group score rises by 118.5%(P ＜0.05).Moreover，ROSgets back to the normal level observed in SB group.Conclusion It was shown that changing with cell count and enhancing of proliferation manifested the protection of SB203580 from radiation induced hematopoietic tissue injury.The protection of SB203580 may attribute to its suppression on ROSgeneration.

book=86,ebook=18

SB203580;bone marrow mononuclear cells;colony-forming unit-granulocyte and monocyte;reactive oxygen species

R962

A

1005-1678(2011)02-0085-03

2010-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30828011，30770645);天津市自然科學(xué)基金資項(xiàng)目(08JCYBJC07300)

翟志斌，男，在讀碩士研究生;孟愛(ài)民，通信作者，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail:ai-min-meng@126.com。