人白介素-15基因系列啟動子克隆及其熒光素酶報告基因載體的構建

陶千山,羅 欣,柴 瑜,胡道軍,張勝權

(安徽醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室,安徽 合肥 230032)

人白介素-15基因系列啟動子克隆及其熒光素酶報告基因載體的構建

陶千山,羅 欣,柴 瑜,胡道軍,張勝權

(安徽醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室,安徽 合肥 230032)

目的 克隆人白介素-15(IL-15)基因系列啟動子,構建 IL-15基因啟動子熒光素酶報告基因載體。方法通過 PCR方法從 HaCaT細胞基因組DNA中獲得 IL-15基因編碼序列 5′上游七段逐步缺失的 IL-15啟動子序列;雙酶切后,分別重組到含螢火蟲熒光素酶的報告基因 p GL3-Basic載體上,構建 IL-15基因系列啟動子報告基因載體;用脂質體轉染法將含最長啟動子序列的報告基因載體轉染至 HaCaT細胞,并設置空白對照組和 LPS組分別處理;24 h后采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測其啟動子活性。結果 經(jīng) PCR方法擴增出七段逐步缺失的 IL-15基因啟動子片段,PCR及雙酶切鑒定各重組體構建正確;瞬時轉染 HaCaT細胞后經(jīng)報告基因檢測得知所克隆最長序列具有啟動子活性。結論 成功構建了 IL-15系列啟動子報告基因載體,并在 HaCaT細胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因調控系列內包含啟動子核心區(qū)域,為進一步研究 IL-15表達調控機制奠定了實驗基礎。

IL-15;啟動子;雙熒光素酶報告基因

人白介素-15(IL-15)是一種重要的可溶性細胞因子[1]。其基因位于 4q31,跨度約 34 kb,含 9個外顯子;成熟的 IL-15是一種糖蛋白,共 114個氨基酸殘基組成,為一種四α-螺旋束結構,含兩個二硫鍵及 C末端兩個糖基化位點[2]。多種細胞和組織均可表達 IL-15,其中表達最高的是外周血單核細胞(PBMC)。IL-15表達異常與一些免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。

IL-15基因表達調控機制復雜,其在多個表達水平受到多種因素的影響。目前的研究較集中于 IL-15基因表達的轉錄水平和翻譯前水平,對于 IL-15基因上游調控序列的研究涉獵不多。為深入分析IL-15基因啟動子的核心區(qū)域以進一步明確其調控機制,我們克隆了 IL-15基因逐步缺失的系列啟動子,構建到報告基因載體 p GL3-Basic上并對其在人角質形成細胞株 (HaCaT細胞)中的活性進行了初步檢測。

1 材 料

p GL3-Basic質粒、phRL-CMV質粒、Dual luciferase reporter Kit、質粒小量提取試劑盒,Promega公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清,GIBCO公司;Lipofectamine 2000,Invitrogen公司;細胞基因組提取試劑盒和凝膠回收試劑盒,Axygen公司;限制性內切酶 KpnⅠ和 XhoⅠ,大連寶生物工程公司;Ex Taq DNA聚合酶和 T4 DNA連接酶,Takara公司;ModulusTM多功能光度計,Turner BioSystems公司;HaCaT細胞和 E.coli JM 109菌株,本室凍存。

2 方 法

2.1 IL-15基因系列啟動子的克隆

2.1.1 引物設計 從 http://genome.ucsc.edu/數(shù)據(jù)庫檢索獲得 IL-15啟動子序列,用 Primer Premier5.0分別設計七對啟動子引物序列 (見表 1),并在上游引物 5′端加入 KpnⅠ的酶切位點 CGGGGTACC,在下游引物 5′端加入 XhoⅠ的酶切位點CCGCTCGAG。

表 1 PCR引物序列表Tab.1 PCR primers′sequence table

2.1.2 細胞培養(yǎng)及基因組提取 HaCaT細胞復蘇后用含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在 37℃,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好時收集對數(shù)生長期細胞,以細胞基因組 DNA提取試劑盒提取其基因組 DNA。

2.1.3 啟動子的克隆 以 HaCaT細胞基因組 DNA為模板 ,分別用 F0、F1、F2、F3、F4、F5、F6為上游引物、R為共同下游引物,經(jīng) 94℃變性 50 s,55℃退火50 s,72℃延伸 1～3 min不等,共 32個循環(huán),PCR擴增獲得七段系列 IL-15基因啟動子片段。然后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定,再切下凝膠上的目的條帶用試劑盒回收純化。

2.2 IL-15系列啟動子報告基因載體的構建與鑒定

將上述克隆的系列啟動子分別經(jīng) KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切、回收,同時將熒光素酶報告基因 p GL3-Basic載體也進行 KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切、回收。然后將各系列啟動子分別與 p GL3-Basic載體在 T4連接酶的作下于 16℃連接 12 h,再以低溫 CaCl2法將連接產(chǎn)物轉化入 E.coli JM 109,涂布于含 100 mg/L氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)皿上過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落培養(yǎng)后經(jīng) 99℃、5 min熱裂解,取上清做PCR鑒定陽性克隆,并以質粒小量提取試劑盒提取質粒進行 KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切鑒定。

2.3 IL-15基因啟動子報告基因載體轉染 HaCaT細胞與活性檢測

將含最長序列 (2 086 bp)啟動子的重組質粒p GL3-Basic-IL-15PromoterF0、陰性對照 p GL3-Basic載體和內參照 phRL-CMV載體經(jīng)紫外分光光度儀測定在 260 nm波長處的吸光度值進行定量。轉染前 1天將 HaCaT細胞以 1×105/孔密度接種于 24孔板,第 2天當細胞約 90%融合時,每孔先加入無血清無雙抗 DMEM 400μL,再分別定量加入含p GL3-Basic-IL-15PromoterF0重組質粒 (或空載體p GL3-Basic,作為對照組)0.8μg,phRL-CMV內參照載體 80 ng和 Lipofectamine 2000 2μL的無血清無雙抗 DMEM混合液 100μL,每組各計 6孔,并設兩組復孔,置 37℃,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。6 h后棄培養(yǎng)液,換成全培養(yǎng)基,并將空載體對照組和重組載體兩組再各分為兩組,其中一組設置為空白對照組,另一組用 100 ng/mL脂多糖 (LPS)處理。18 h后棄培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液洗一遍,以被動裂解液 (PLB)在室溫下輕晃 15 min裂解細胞,再取裂解液 20μL加底物熒光素 (LARⅡ)100μL在ModulusTM多功能光度計上測定螢火蟲熒光素酶活性,后加入終止液 100μL檢測海腎熒光素酶活性,計算兩種熒光素酶活性的比值,并以空載體 p GL3-Basic比值作對照,分析啟動子活性。

3 結 果

3.1 IL-15基因系列啟動子的克隆

以 HaCaT細胞基因組 DNA為模板,克隆出七段 IL-15基因系列啟動子,分別命名為 F0 2 086 bp;F1 1 841 bp;F2 1 586 bp;F3 1 236 bp;F4 1 084 bp;F5 827 bp;F6 548 bp(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR agarose gel electrophoresis

3.2 IL-15啟動子報告基因載體的 PCR鑒定

如圖 2所示,從挑選的陽性單克隆菌落裂解液中 PCR擴增到 IL-15基因的系列啟動子,初步證實重組體構建成功。

圖2 PCR鑒定電泳圖Fig.2 The electrophoresis of PCR for identification

3.3 IL-15啟動子報告基因載體的酶切鑒定

經(jīng) KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切后,各重組體均得到同一大小的空載體 p GL3-Basic(4 808 bp)片段和不同大小的系列啟動子片段,進一步證實 IL-15系列啟動子報告基因載體構建成功 (圖 3)。

圖3 空載體 p GL3-Basic及雙酶切電泳圖Fig.3 The electrophoresis of p GL3-Basic and double digestion for identification

3.4 啟動子活性的檢測

報告基因熒光檢測顯示,p GL3-Basic空載體及p GL3-Basic-IL-15PromoterF0重組體轉染 HaCaT細胞后表現(xiàn)出啟動子活性。圖 4所示為重組體 F0與空載體各自的螢火蟲熒光值與海腎熒光值之比,其中空白對照組的 F0重組體/空載體熒光比值為1.35;LPS組的 F0重組體 /空載體熒光比值為5.23;p GL3-Basic-IL-15PromoterF0的 LPS組 /空白對照組熒光比值為 4.05(各數(shù)據(jù)比較:P＜0.05),說明 LPS組及空白對照組其重組體 F0轉染前后的熒光值有差異,且 LPS組更明顯。由此可得 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0具有啟動子活性,提示所克隆及重組的 IL-15基因 5′上游 2 086 bp片段內包含核心啟動子序列。

圖4 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0啟動子活性Fig.4 The activity of p GL3-Basic-IL-15PromoterF0

4 討 論

IL-15在機體自然免疫中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[3-4]。IL-15功能多樣,涉及外周血 T細胞的增殖、活化B細胞抗體的分泌、NK細胞的增殖和細胞因子的分泌[5]及抗病毒作用[6]等,其正常表達是機體自然免疫功能的重要維系,異常表達則與類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病和艾滋病等密切相關[2],因此研究 IL-15基因表達調控及其機制具有重要的現(xiàn)實意義。

目前對 IL-15基因表達調控機制研究還處在一個不充分的水平,人們僅發(fā)現(xiàn)在其基因調控序列中存在有常見的保守性序列,即 IRF[7],NF-κB[8],g-IRE,myb和 GCF等結合位點,部分與 IL-15調控有關的未知序列[9]以及由 mRNA翻譯成前體蛋白過程中的幾個調控點[10]。我們的研究意在尋找 IL-15基因 5′上游調控序列的核心啟動子區(qū)域,試圖更加充實和完善 IL-15基因表達的調控機制。

報告基因技術近年來普遍用于分析啟動子活性,尤其是單管雙報告酶系統(tǒng),其靈敏度高、檢測方便且具有內參照系統(tǒng) phRL-CMV,可以實現(xiàn)實驗報告基因測試的歸一化,提高實驗的準確度。因此我們根據(jù)相關啟動子分析軟件設計了七對逐步缺失的啟動子引物,經(jīng) PCR從 HaCaT細胞基因組克隆出系列啟動子構建到含螢火蟲熒光素酶的報告基因載體p GL3-Basic上,然后經(jīng)過 PCR和雙酶切鑒定,證實成功構建 IL-15基因系列啟動子報告基因載體。在此基礎上,對啟動子活性的初步分析中我們選擇了其中一個含最長啟動子序列的報告基因載體 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0(同時另轉染空載體 p GL3-Basic做陰性對照)和內參照海腎報告基因載體phRL-CMV一同經(jīng) Lipofectamin 2000轉染至 HaCaT細胞,同時設置空白對照組和 LPS組處理,經(jīng)熒光檢測后發(fā)現(xiàn)兩組均具有啟動子活性,且 LPS組活性較空白對照組更明顯。這進一步證實報告基因載體構建成功,同時也證明我們選擇的 IL-15基因調控序列中包含其核心啟動子序列,為下一步 IL-15基因表達調控機制的研究奠定了實驗基礎。

[1] Grabstein K H,Eisenman J,Shanebeck K,et al.Cloning of a Tcell growth factor that interacts with theβchain of the interleukin-2 receptor[J].Science,1994,264(5161):965-968.

[2] Fehniger TA,CaligiuriM A.Interleukin 15:biology and relevance to human disease[J].Blood,2001,97(1):14-32.

[3] Ohteki T,Tada H,Ishida K,et al.Essential roles of DC-derived IL-15 as a mediator of inflammatory responses in vivo[J].JEM,2006,203(10):2329-2338.

[4] Tran P,Ahmad R,Xu J,et al.Host′s innate immune response to fungal and bacterial agents in vitro:up-regulation of interleukin-15 gene expression resulting in enhanced natural killer cell activity[J].Immunology,2003,109(2):263-270.

[5] Boyiadzis M,Memon S,Carson J,et al.Upregulation of NK cell activating receptors following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation under a lymphodepleting reduced intensity regimen is associated with elevated IL-15 levels[J].Biol Blood Marrow Transplant,2008,14(3):290-300.

[6] Gill N,Ashkar A A.Overexpression of interleukin-15 compromises CD4-dependent adaptive immune responses against herpes simplex virus2[J].Virology,2009,83(2):918-926.

[7] Ogasawara K,Hida S,Azimi N,et al.Requirement for IRF-1 in the microenvironment supporting development of natural killer cells[J].Nature,1998,391(1):700-703.

[8] Washizu J,Nishimura H,Nakamura N,et al.The NF-kappaB binding site is essential for transcrip tional of the IL-15 gene[J].Immunogenetics,1998,48(1):1-7.

[9] Azimi N,Brown K,Bamford RN,et al.Human T cell lymphotropic virus typeⅠTax protein trans-activates interleukin 15 gene transcription through an NF-kappaB site[J].Proc Natl Acad SciUSA,1998,95(5):2452-2457.

[10]Kozak M.Regulation of translation in eukaryotic systems[J].Annu Rev Cell Dev Biol,1992,8:197-225.

Construction of human IL-15 gene promoter luciferase reporter gene vectors

TAO Qian-shan,LUO Xin,CHA IYu,HU Dao-jun,ZHANG Sheng-quan
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

Purpose To clone series of the human IL-15 gene promoter and to construct seven luciferase reporter gene vectors containing IL-15 promoter regions.Methods Seven DNA fragments of the 5′flanking region of human IL-15 gene were isolated from genomic DNA of HaCaT cellsby polymerase chain reaction(PCR).After being digested with restriction enzymes,IL-15 gene family promoters were inserted into the luciferase reporter vectors PGL3-Basic.Then the recombinant construct which contains the largest IL-15 promoter region was transiently transfected into HaCaT cells.6 hours later,cells were respectively treated with DMEM,LPS.Then the activity of luciferase was detected.Results Seven-fragments of IL-15 gene promoter were amplified by PCR,and the identification of PCR and double digestion of recombined plasmid was completely correct.The experiment of transient transfection showed that the largest IL-15 promoter region has the significant activity.Conclusion The human IL-15 gene promoter luciferase reporter gene vectors have been constructed successfully.The analysis of activity in HaCaT cells indicated that the cloned IL-15 gene family promoters contain the key cis-regulatory elements.It will be essential to further study the regulation of IL-15 expression.

IL-15;Promoter;Dual luciferase reporter gene

Q782;Q785

A

1005-1678(2011)03-0187-04

2010-06-28

安徽省自然科學基金 (050430604);安徽省重點實驗室優(yōu)秀中青年科研帶頭人專項基金

陶千山,男,在讀碩士研究生;張勝權,通信作者,副教授,博士,E-mail:sqz36@yahoo.com。