有氧跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬內(nèi)CREB mRNA表達(dá)的影響

于海珍，范海霞，徐 波

●研究報(bào)道

有氧跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬內(nèi)CREB mRNA表達(dá)的影響

于海珍1，范海霞2，徐 波3

目的：研究8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬內(nèi)CREBmRNA表達(dá)的影響。材料與方法：選用健康雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（C組，n=10）和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（T組，n=10），運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行為期8周的有氧跑臺(tái)訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5次，第8周對(duì)C組和T組進(jìn)行為期6天的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠海馬CREBmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練增強(qiáng)T組大鼠在Morris水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)上調(diào)T組大鼠海馬內(nèi)CREB（上調(diào)28.8%）的基因表達(dá)。結(jié)論：8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這可能與跑臺(tái)訓(xùn)練顯著上調(diào)大鼠海馬CREBmRNA的表達(dá)有關(guān)。

有氧跑臺(tái)訓(xùn)練；學(xué)習(xí)記憶；海馬；CREB

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)了解到一些與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因及其功能，其中環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）就是一種重要的核轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子，它具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能，它能夠刺激特定基因，制造蛋白質(zhì)，強(qiáng)化細(xì)胞彼此的連接。S.Vaynman等研究表明，成年SD大鼠分別進(jìn)行3天和7天的自愿跑輪運(yùn)動(dòng)，其CREBmRNA水平顯著升高（P＜0.05），3天后上調(diào)到118%，7天后上調(diào)到136%，并認(rèn)為跑輪訓(xùn)練提高大鼠海馬可塑性可能與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)CREBmRNA升高有關(guān)[1]。Shen等人報(bào)道一次自愿跑輪運(yùn)動(dòng)可增加大鼠海馬磷酸化的CREB，而且發(fā)現(xiàn)，CREB與BDNF基因CRE序列的結(jié)合增加，增強(qiáng)CREB靶基因BDNF基因的轉(zhuǎn)錄，CREB的激活水平可持續(xù)一周[2]。Vaynman等發(fā)現(xiàn)一周自愿運(yùn)動(dòng)不僅可增加大鼠海馬CREB活性，而且發(fā)現(xiàn)CREBmRNA表達(dá)增加，同時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力加強(qiáng)[3]。這些研究表明，一周內(nèi)的自愿跑輪運(yùn)動(dòng)都能增加CREB的基因表達(dá)，即短期的有氧運(yùn)動(dòng)能增強(qiáng)CREBmRNA的表達(dá)，那么長(zhǎng)期的有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)是否能增強(qiáng)CREB基因表達(dá)呢？基于這方面的思考，本研究將以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究8周有規(guī)律的有氧跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠CREB基因表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及訓(xùn)練模型

健康雄性6周齡Sprague－Dawley（SD）大鼠20只，體重（164.92±3.10）g，由中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2007－0003。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：通風(fēng)，自然光照，室溫（22±1）℃。實(shí)驗(yàn)前，隨機(jī)將大鼠分為安靜對(duì)照組（C組，n=10）和運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)組（T組，n= 10），采用喬山跑臺(tái)改裝成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，直接對(duì)T組大鼠進(jìn)行8周正式的有氧跑臺(tái)訓(xùn)練，每周運(yùn)動(dòng)5次，訓(xùn)練均安排在每周的周二至周六晚間進(jìn)行。第8周對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行Morris水迷宮學(xué)習(xí)測(cè)試，均在上下午進(jìn)行。另外，根據(jù)嚙齒類動(dòng)物的生活習(xí)性，所有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均安排在晚上6點(diǎn)之后的固定時(shí)間段進(jìn)行（見表1）。

1.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)程序

實(shí)驗(yàn)前一天將T組和C組大鼠分別放入水中自由游泳2 min，使其熟悉水迷宮環(huán)境。測(cè)試程序主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。平臺(tái)設(shè)置在第一象限內(nèi)。記錄大鼠自入水至找到平臺(tái)四肢爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，作為逃避潛伏期。

1.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5天，每天分上、下午各一個(gè)訓(xùn)練程序，每只大鼠在一個(gè)程序內(nèi)訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)將每只大鼠分別從4個(gè)象限面向池壁放入水中，計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)并記錄大鼠從入水開始尋找至找到并爬上平臺(tái)所需時(shí)間（潛伏期），如果大鼠2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其牽引到平臺(tái)，并停留30～60 s，這時(shí)潛伏期記為2 min，每次訓(xùn)練間隔60 s，共訓(xùn)練10個(gè)程序。

1.2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 在上述訓(xùn)練結(jié)束后拆除平臺(tái)，然后選平臺(tái)相對(duì)象限為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄2 min內(nèi)大鼠在各象限區(qū)域內(nèi)游泳的時(shí)間占總時(shí)間的百分比；記錄它們穿越原有平臺(tái)的次數(shù)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣本采集 將動(dòng)物斷頸椎處死后，取頭，打開顱腔，取雙側(cè)海馬組織，所有操作均在冰上進(jìn)行，將取出的海馬置液氮速凍后，－80℃保存，待測(cè)。取材過(guò)程均由固定人員操作。

1.3.2 總RNA提取 取凍存海馬放在手動(dòng)玻璃勻漿器中，加1 mmLTrizol，充分勻漿（放在碎冰上操作），采用Trizol法提總RNA，然后用石英比色皿和酶標(biāo)儀檢測(cè)OD260/OD280比值，DEPC水做空白調(diào)零，再用DEPC水將RNA樣品按一定比例稀釋?；靹蚝笤?50～310 nm波長(zhǎng)之間掃描樣品的動(dòng)態(tài)吸收譜。計(jì)算OD260/OD280比值，選取比值接近2.0的RNA（每組選取8個(gè)質(zhì)量最優(yōu)的）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的組分（反應(yīng)總體積為20 μL體系）：OligoDT（1 μL），DdH20（2.5 μL），RNA樣品（9.5 μL，OD260=1相當(dāng)于RNA濃度40 μg/mL，RNA樣品濃度（μg/mL）=[OD260－OD310]×稀釋倍數(shù)×40），RT緩沖液（4 μL），dNTP混合液（1 μL），RNA酶抑制劑（1 μL），M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（1 μL）。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系（總體積20 μL）：2×SYBR green PCR MasterMix（10 μL）包含下列成分：SYBR green I、HotStart Taq DNA Polymerase、Reaction Buffer、dNTP、Mg2+，預(yù)混液包含下列成分：Forward Primer（10 μM）（1μL）、Reverse Primer（10 μM）（1 μL）、RNase free water（4 μL），cDNA模板（4 μL）。

以β－actin作為內(nèi)參，引物序列為：CREB：F 5'ATTTCAT TACAAAGGGCGCAAA3'R5'ATATATGCAAATGGCTGGTCCC3'，β－actin：F 5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3'R 5'ATACTCCTGCT TGCTGATCC3'。以上引物序列查自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

溫度循環(huán)參數(shù)：Step 1：預(yù)變性[95℃，60 s]；Step 2：[95℃，15 s；61℃，25 s；72℃，45 s，收集熒光]×40個(gè)循環(huán)；Step 3：建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，再變性[95℃，60 s]，退火[55℃，45 s]，然后從55℃緩慢加熱到95℃，15 s；每1℃收集熒光。

反應(yīng)結(jié)果：熔解曲線只顯示一個(gè)主波峰，表明PCR擴(kuò)增的特異性較高，符合熒光定量PCR的技術(shù)要求。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β－actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2－ΔCt計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct'（樣品的Ct值）－Ct（β－actin的Ct值）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算，數(shù)據(jù)處理使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，其中P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié) 果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，在迷宮測(cè)試的第一天，兩組大鼠的潛伏期不存在顯著性差異，但T組潛伏期的平均值明顯小于C組，從第二天開始兩組的潛伏期存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2和圖3所示，分析大鼠在第6天的空間搜索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，在拆除平臺(tái)后，大鼠在2 min內(nèi)均表現(xiàn)出對(duì)原有平臺(tái)的記憶，一進(jìn)入水中就表現(xiàn)出對(duì)原有平臺(tái)的搜索。T組大鼠穿越站臺(tái)位置的次數(shù)多于C組，但沒(méi)有顯著性差異；T組大鼠在第一象限時(shí)間百分比大于C組，但差異不顯著。

2.3 海馬CREB mRNA測(cè)定結(jié)果

從數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以看出，8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練之后，T組大鼠海馬CREB mRNA表達(dá)的平均值都顯著高于C組（P＜0.05），T組上調(diào)28.8%。

3 討 論

Radak等對(duì)幼年和老年大鼠進(jìn)行了為期9周的游泳訓(xùn)練，通過(guò)主動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)測(cè)試發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的游泳訓(xùn)練能提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)7周自愿跑輪運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的獲得顯著優(yōu)于安靜組[5]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，兩組大鼠潛伏期的變化差異顯著：從實(shí)驗(yàn)的第一天開始，T組大鼠的潛伏期就小于C組，第二天起，T組大鼠潛伏期的測(cè)試成績(jī)與C組比較呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。這表明T組大鼠的學(xué)習(xí)能力明顯好于C組，學(xué)習(xí)記憶能力提高的速度也明顯高于C組?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)是在撤去平臺(tái)下大鼠進(jìn)行尋找平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)，與前5天的定位航行實(shí)驗(yàn)相比，環(huán)境發(fā)生了變化，大鼠在尋找平臺(tái)時(shí)會(huì)受到環(huán)境的影響，因此雖然T組在穿越平臺(tái)次數(shù)以及第一象限游泳時(shí)間百分比都大于C組，但不具有顯著性差異，這表明T組對(duì)原有平臺(tái)空間位置的記憶保持能力與C組差異不大但還是要好于C組。因此，綜合定位航行實(shí)驗(yàn)及空間搜索實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)仍然可以說(shuō)明長(zhǎng)期有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以使學(xué)習(xí)記憶能力得到提高。

CREB[6]是存在于真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組成性轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳遞途徑，把細(xì)胞膜的變化轉(zhuǎn)變?yōu)榛虮磉_(dá)水平的變化，具有調(diào)節(jié)精子生成、晝夜節(jié)律、學(xué)習(xí)記憶等功能。研究表明，當(dāng)在學(xué)習(xí)記憶行為訓(xùn)練前向大鼠海馬內(nèi)注入CREB反義寡核苷酸而阻止CREB的作用，可導(dǎo)致其Morris水迷宮的空間學(xué)習(xí)缺損[7]；而訓(xùn)練前雙側(cè)穹窿海馬傘被切斷的大鼠，也可因海馬CREB磷酸化水平不能升高而使逃避性記憶受損[8]。最近報(bào)道，老年大鼠海馬CA1區(qū)CREB磷酸化水平下降[9]，這表明CREB參與到與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力下降的機(jī)制。由此可見，CREB的活化在學(xué)習(xí)和記憶的形成過(guò)程起到重要的作用，是記憶儲(chǔ)存不可缺少的轉(zhuǎn)錄因子。那么CREB是通過(guò)怎樣的作用途徑促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的呢？有報(bào)道認(rèn)為磷酸化的CREB促進(jìn)了CRE序列的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)位于其下游的大量基因如即刻早基因（c－fos等）和編碼突觸素Ⅰ、CaMKⅡ[10]、BDNF等基因的轉(zhuǎn)錄[11]，形成新的突觸聯(lián)系，從而使獲得的信息得以長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練增強(qiáng)了T組大鼠海馬CREBmRNA的表達(dá)水平，其表達(dá)量的平均值顯著高于C組（P＜0.05），上調(diào)28.8%。這提示，長(zhǎng)期適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)腦內(nèi)CREBmRNA的表達(dá)，進(jìn)而有益于學(xué)習(xí)記憶能力的增強(qiáng)。馬強(qiáng)等人采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)28只成年雄性Wistar大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行4周自愿跑輪運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)組大鼠，海馬內(nèi)CREBmRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）[12]。R Molteni等人研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行1個(gè)月和2個(gè)月跑輪訓(xùn)練能使高脂進(jìn)食（HF）大鼠海馬pCREBmRNA顯著增加，并逆轉(zhuǎn)由HF所引起的記憶缺陷[13]。本實(shí)驗(yàn)表明，8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練促使大鼠腦內(nèi)海馬CREBmRNA表達(dá)量增加，增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

4小 結(jié)

本研究結(jié)果顯示，8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練可以提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并顯著性地增強(qiáng)大鼠海馬內(nèi)CREBmRNA的表達(dá)。由此我們可以推測(cè)，運(yùn)動(dòng)引起的大鼠海馬內(nèi)CREBmRNA表達(dá)的增加可能是運(yùn)動(dòng)促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

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Effects of Treadmill Training on Rats'Learning and Memory and CREB mRNA Expression in Hippocampus

YU Haizhen1，F(xiàn)AN Haixia2，XU Bo3
（1.Shanghai Aurora Vocational College，Shanghai 201908，China；2.School of Higher Vocational Education，Shanghai University of Engineering Science，Shanghai 200437，China；3.School of PE and Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Aims：To explore the effects of 8－week aerobic treadmill training on learning and memory and CREBmRNA expression in hippocampus of rats.Materials&methods：Healthy male Spargue－Dawley rats were selected and assigned randomly into two groups：controlled（C，n=10），trained（T，n=10）.The rats of trained group took part in running training for 8 weeks，5 times every week.All groups participate in the Morris Water Maze tested for 6 days during the 8th week.The expression level of CREBmRNA in hippocampus of all rats are inspected by real－time fluorescence quantitative PCR.Results：8－week aerobic treadmill training can enhance the abilities of learning and memory of T group of rats in MWM and significantly up－regulate the expression of CREBmRNA（28.8%）in hippocampus.Conclusion：8－week aerobic treadmill training can improve the abilities of learning and memory of rats，which may relate with the high expression of CREBmRNA in hippocampus of rats.

aerobic treadmill training；learning and memory；hippocampus；CREB

G 804.7

A

1005-0000（2011）06-0539-03

2011-09-16；

2011-10-25；錄用日期：2011-10-27

于海珍（1978-），女，江蘇邳州人，講師，研究方向?yàn)轶w育運(yùn)動(dòng)與身心健康。

1.上海震旦職業(yè)學(xué)院體育部，上海201908；2.上海工程技術(shù)大學(xué)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海200437；3.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241。

表1 動(dòng)物訓(xùn)練模型
Tab.1 The training model of the rats

注：8周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練每周5次；水迷宮實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6天，前5天每天分上下午各一個(gè)訓(xùn)練程序，每個(gè)程序4次，第6天進(jìn)行記憶能力的測(cè)試。

飼養(yǎng)時(shí)間 第1～3周 第4周 第5周 第6周 第7周 第8周跑速/km·h-10.8 0.8 0.9 0.9 0.9 0.9時(shí)間/m·d-130 40 45 50 60 60坡度/° 0 5 5 5 5 5水迷宮/t·d-18