農(nóng)藥高效氯氰菊酯對小鼠腎細(xì)胞氧化損傷的研究

馬 萍，丁書茂，秦龍娟，張亞然，杜 娟，楊 旭＊＊

（1.咸寧學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079）

高效氯氰菊酯（beta－cypermethrin，β－CP）是目前國內(nèi)最常用一種高效、廣譜、速效的殺蟲劑，屬于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，其活性比普通的氯氰菊酯（cypermethrin，CP）高1倍，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲、衛(wèi)生害蟲、畜牧害蟲、儲糧害蟲等的防治.隨著β－CP使用范圍的不斷擴大和使用量的增加，長期低濃度接觸β－CP引發(fā)的人類的安全性問題日益受到人們的關(guān)注，對其毒性作用的研究表明，它對人和動物神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)都有影響［1－2］.李海峰等以家兔為試驗材料，安麗等以大鼠為試驗材料，都發(fā)現(xiàn)β－CP有生殖毒性［3－4］.安麗等發(fā)現(xiàn)，β－CP對雄性小鼠體液免疫功能有抑制作用，此種作用可能與該農(nóng)藥對脾臟B淋巴細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)［5］.佟俊旺等通過彗星實驗證明CP的染毒濃度80mg／kg時，能夠造成小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷［6］.到目前為止，對該殺蟲劑氧化損傷的研究報道較少，本研究特采用目前最常用的4.5%β－CP乳油對小鼠進(jìn)行染毒，通過對小鼠腎臟ROS、GSH和DPC系數(shù)的測定研究其氧化損傷，為β－CP的生產(chǎn)、使用和管理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

F－4500型熒光分光光度計（日本日立公司），熒光酶標(biāo)儀（FLx 800，Bio－Tek Instrument Inc，USA），酶標(biāo)儀（日本島津），低溫冷凍離心機（Eppendorf－5415R），三用電熱恒溫水箱（北京市長源實驗儀器廠），H2DCF－DA 熒光染料（Sigma公司），蛋白酶K（Merk公司），Hoechst33258熒光染料（Sigma公司），十二烷基硫酸鈉（SDS），三羥基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris－HCl），5，5′－二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）.

1.2 受試農(nóng)藥

4.5 %高效氯氰菊酯乳油，南京紅太陽股份有限公司生產(chǎn).

1.3 實驗動物

選用湖北省實驗動物研究中心提供的SPF級雄性昆明小鼠24只，體重為30±2g，飼養(yǎng)1周后實驗.

1.4 分組和染毒

24只昆明小鼠隨機分為1個陰性對照組和3個β－CP染毒組，每組6只.參考文獻(xiàn)［6－8］，染毒組分為低、中、高劑量組，確定染毒劑量分別為10、20和40mg／kg 3個劑量水平，β－CP以蒸餾水稀釋成1、2和4mg／ml 3種濃度的使用液.由于β－CP難溶于水，故稀釋液需現(xiàn)用現(xiàn)配，使用時在旋渦混懸儀上充分混勻.陰性對照組用蒸餾水.均經(jīng)口灌胃給予，灌胃量為10mg／kg，每天1次，連續(xù)染毒7d，分別于實驗前稱小鼠體重，小鼠可以自由進(jìn)食，進(jìn)水.

1.5 腎臟勻漿和細(xì)胞懸液的制備

染毒結(jié)束后將小鼠頸椎脫臼處死，立即取出腎臟，在冰冷的PBS（pH＝7.5）中漂洗，濾紙拭干，稱重.腎細(xì)胞分成兩部分，一部分取腎臟0.2g加2mL PBS制成10%勻漿液，低溫離心后取上清，用于ROS和GSH的檢測.另一部分腎臟剪成糜狀，過濾后將細(xì)胞濾液離心去上清，再用PBS重懸細(xì)胞，用于DPC系數(shù)的檢測.

1.6 實驗方法

1.6.1 活性氧（ROS）的測定 取10%勻漿液2μL，加入398μL PBS作200倍稀釋.取100μL稀釋液于酶標(biāo)板中排列，并加入100μL熒光染料DCFA染色，避光反應(yīng)5min，用熒光酶標(biāo)儀檢測.

1.6.2 谷胱甘肽（GSH）的測定 取10%勻漿液200μL于EP管中，加入50μL10%TCA，混勻后置冰上10min.10 000g離心5min，取上清，將50μL上清加50μLPBS并調(diào)節(jié)pH至7.5.取50μL樣品加入酶標(biāo)板，分別加入150μL濃度為60μg·mL－1的 DTNB顯示液，室溫避光5min，用全波長酶標(biāo)儀在412nm波長下測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得GSH的濃度（以n mol／L表示）.

1.6.3 DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)（DPC）系數(shù)的測定 DPC

采用 KCl－SDS沉淀法進(jìn)行檢測［9－10］.首先向樣品中加入SDS，使之與DPC及蛋白質(zhì)結(jié)合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白質(zhì)沉淀，而游離的DNA留在上清液中.將上清液轉(zhuǎn)移后，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質(zhì)，使DPC中的DNA游離出來，用熒光法測定此DNA的含量A（交聯(lián)DNA）以及原液中 DNA 的含量 B（游離 DNA），計算DPC系數(shù)η（η＝A／A＋B）.

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用Mean±se表示，采用Origin 7.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并進(jìn)行t檢驗并繪圖.

2 實驗結(jié)果

2.1 ROS含量的變化

不同劑量的β－CP染毒小鼠后，其腎臟ROS含量的變化如圖1所示.從圖1可看出，隨著β－CP染毒劑量的升高，ROS含量逐漸上升，呈一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系.低劑量組（≤10mg／kg）與對照組無顯著差異（p＞0.05），中、高低劑量組（≥20mg／kg）與對照組有顯著差異（p＜ 0.05）.以上結(jié)果表明，較高劑量的β－CP能造成ROS含量的上升.

圖1 不同劑量的高效氯氰菊酯染毒小鼠腎臟ROS含量（＊：與對照組相比較，p＜0.05）Fig.1 ROS content in mouse kidney induced by different dose of beta－cypermethrin

圖2 不同劑量的高效氯氰菊酯染毒小鼠腎臟GSH含量（＊＊：與對照組相比較，p＜0.01）Fig.2 GSH content in mouse kidney induced by different dose of beta－cypermethrin

2.2 GSH含量的變化

不同劑量的β－CP染毒小鼠后，其腎臟GSH含量的變化如圖2所示.從圖2可看出，隨著β－CP染毒劑量的升高，GSH含量逐漸下降，呈一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系.低劑量組（≤10mg／kg）與對照組無顯著差異（p＞ 0.05），中、高劑量組（≥20mg／kg）與對照組有極顯著差異（p ＜0.01）.以上結(jié)果表明，在較高劑量的β－CP作用下，小鼠腎臟的GSH含量有明顯的下降.

2.3 DPC系數(shù)的變化

用KCl－SDS沉淀法檢測DPC系數(shù)，其腎臟DPC系數(shù)變化如圖3所示.從圖3可看出，隨著β－CP染毒劑量的升高，DPC系數(shù)逐漸上升，呈一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系.低劑量組（≤10mg／kg）與對照組無顯著差異（p＞0.05），中、高劑量組（≥20mg／kg）與對照組有顯著差異（p＜0.05）.

圖3 不同劑量的高效氯氰菊酯染毒小鼠腎臟DPC系數(shù)（＊：與對照組相比較，p ＜0.05）Fig.3 DPC coefficient in mouse kidney induced by different dose of beta－cypermethrin

3 討論

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國.長期以來，我國農(nóng)藥的使用表現(xiàn)為總量大、殺蟲劑比例大、過量和不合理使用、農(nóng)藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象突出等特點.農(nóng)藥通過食物、職業(yè)接觸和居住環(huán)境接觸等途徑被人體吸收，嚴(yán)重危害人類健康［11］.高效氯氰菊酯是目前國內(nèi)最常用一種殺蟲劑，本研究用小鼠腎臟作ROS、GSH和DPC系數(shù)的檢測來評價其氧化損傷是非常有必要的.

反映細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平的主要指標(biāo)是細(xì)胞中ROS含量，機體的正常代謝可以產(chǎn)生一定水平的ROS，組織細(xì)胞中活性氧的主要產(chǎn)生者是線粒體［12］.正常細(xì)胞中，一些ROS能夠被抗氧化機制所中和，比如還原型的GSH可以和ROS結(jié)合形成硫代半縮醛，氧化與抗氧化水平保持動態(tài)平衡.如果ROS生成過量，會導(dǎo)致GSH耗竭，機體天然的抗氧化機制將被破壞.活性氧還可通過攻擊脫氧核糖、攻擊胸腺嘧啶堿基、增高細(xì)胞內(nèi)游離ca2＋濃度，激活Ca2＋依賴的核酸內(nèi)切酶和攻擊修復(fù)DNA鏈斷裂的酶來導(dǎo)致DNA鏈斷裂［11］.氧自由基對細(xì)胞的氧化損傷作用還會引起DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)［13］.DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)難以修復(fù)，對參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)的蛋白質(zhì)活動起阻礙作用.

在本研究中，隨著β－CP染毒劑量的升高，ROS含量逐漸上升，GSH含量逐漸下降，DPC系數(shù)逐漸上升，各項指標(biāo)呈一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系.β－CP染毒劑量≥20mg／kg時，ROS和DPC系數(shù)有顯著差異（p＜ 0.05），GSH 有極顯著差異（p＜0.01）.說明在較高劑量的β－CP誘導(dǎo)之下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了過量的ROS，受到ROS攻擊，細(xì)胞的抗氧化能力下降，DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)增多，造成了小鼠腎臟的氧化損傷.

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，β－CP染毒劑量≥20mg／kg時，造成了小鼠腎臟的氧化損傷，且損傷程度與β－CP劑量濃度有一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，但β－CP造成氧化損傷的機制還需進(jìn)一步探討.

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