大強度耐力訓(xùn)練和不同劑量補鐵對大鼠血清鐵、血紅蛋白及骨骼肌線粒體呼吸鏈功能的影響

李潔 王博

西北師范大學(xué)體育學(xué)院（蘭州730070）

鐵參與體內(nèi)眾多生化反應(yīng)并發(fā)揮重要作用，對維持運動能力至關(guān)重要。研究表明，大強度運動引起鐵缺失甚至缺鐵性貧血。機體鐵代謝紊亂（鐵缺乏）導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，血紅蛋白（Hb）攜氧能力下降以及能量代謝失調(diào)，影響運動員的能量代謝水平，使其運動能力下降［1，2］。營養(yǎng)干預(yù)明顯改善運動訓(xùn)練引起的鐵代謝紊亂［3］。血清鐵蛋白（SF）較低的女運動員補鐵后，SF和Hb均明顯增加［4］。 另有研究表明，缺鐵影響大鼠骨骼肌的工作能力，并使骨骼肌線粒體鐵硫蛋白（Fe-S）下降［5］，肌紅蛋白含量下降40%～60%，細胞色素氧化酶活性及電子傳遞能力下降50%，而且耐力成績恢復(fù)與組織鐵濃度回升密切相關(guān)［6］。骨骼肌是評價運動能力重要的靶器官，為了進一步明確鐵影響有氧能力的機制，本研究以大鼠骨骼肌細胞為研究對象，施加大強度耐力訓(xùn)練及不同劑量補鐵，通過測定大鼠血清鐵、血紅蛋白含量及骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性，探討大強度耐力訓(xùn)練及補鐵對機體鐵代謝及能量代謝的影響，為合理應(yīng)用營養(yǎng)補劑提高機體有氧工作能力的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康5周齡Wistar大鼠50只，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（甘）2005-0007，體重100 g左右，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，室溫（23±2）℃，相對濕度（50±10）%，自然采光，飼養(yǎng)室、用具等每周用紫外燈滅菌一次。本實驗在西北師范大學(xué)體育學(xué)院運動人體科學(xué)實驗中心完成。

1.2 動物適應(yīng)性訓(xùn)練、篩選及分組

大鼠購入后在動物房飼養(yǎng)2天，以適應(yīng)環(huán)境。然后所有大鼠進行1次/天、共2天的水平跑臺適應(yīng)性運動，跑臺速度從10 m/min開始遞增到15 m/min，運動時間10 min，使大鼠熟悉跑臺。根據(jù)體重、跑臺運動適應(yīng)情況，淘汰體重過輕或過重、不適應(yīng)跑臺運動的大鼠，保留40只大鼠進行分組實驗。

篩選出的40只大鼠隨機分為5組，每組8只：安靜對照組（C組）、訓(xùn)練組（T組）、小劑量補鐵+訓(xùn)練組（S組）、中劑量補鐵+訓(xùn)練組（M組）和大劑量補鐵+訓(xùn)練組（L組）。

1.3 訓(xùn)練方案

訓(xùn)練方案參見文獻［3，7］。訓(xùn)練大鼠進行速度為30 m/min的水平遞增負荷跑臺運動，第1～2周每天早上訓(xùn)練1次，運動時間從5 min開始，每次遞增2 min。第3～4周每天訓(xùn)練2次（早、晚各1次），每次遞增2 min。最后一次運動時間為75 min。第5～8周每天訓(xùn)練2次（早、晚各1次），第5周運動時間為80 min，第6周運動時間為85 min，第7周運動時間以90 min開始、之后以2 min/次進行遞增，第8周末運動時間達到136 min，6 d/周（表1）。若訓(xùn)練中大鼠出現(xiàn)嚴重力竭癥狀（連續(xù)施加機械刺激大鼠不能繼續(xù)跑動、下跑臺后腹部觸地嚴重呈甲魚狀），則允許其休息2～5 min后繼續(xù)運動。

表1 大鼠跑臺運動時間（min）

1.4 補鐵及劑量

第5～8周，補鐵大鼠灌胃補充硫酸亞鐵溶液，1次/d。小劑量為28.85 mg/d/kg，中劑量為57.7 mg/d/kg，大劑量為115.4 mg/d/kg［8］。 每周一稱1次體重。

1.5 取樣及線粒體制備

訓(xùn)練結(jié)束后24 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，由腹主動脈取血。20 μl即刻用于測定Hb含量，其余血樣注入離心管，37℃保溫30 min，3000 r/min離心15 min，分離血清，放入-20℃低溫保存，用于血清鐵的測定。取血后，于冰盤上迅速取出股四頭肌，在冷生理鹽水中除去脂肪等結(jié)締組織后，濾紙吸干，置于液氮中冷凍，-20℃低溫保存待用。

將低溫保存的骨骼肌樣本取出，0～4℃放置融化，在冰浴中將股四頭肌剪成碎塊，并按重量體積比（1∶5）加入勻漿緩沖液 （緩沖液組成：250 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA，pH 7.4）勻漿。按文獻［9］差速離心提取線粒體。將制備的線粒體用 懸 浮 液 （30 mmol/L蔗 糖 、20 mmol/L Tris-HCl、0.1%BSA，pH 7.2）懸浮待用。

1.6 測試指標(biāo)及方法

按血紅蛋白計測定說明測定血紅蛋白（Hb）含量。按測試盒操作程序測定血清鐵含量。參照Vyatlina等［10］的方法測定線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ（CⅠ～CⅣ）活性。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。

藥品與試劑：2，3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1，4-benzoquinone（DB，CoQ0）、NADH、rotenone（魚藤酮 ）、Cyt c （ 細 胞 色 素c）、antimycin （ 抗 霉 素 ）、Dodecyl-β-D-maltoside （β-裂解劑）、bovine serum albumin（BSA，牛血清白蛋白）、考馬斯亮藍G250為sigma 公 司 產(chǎn) 品 ，2，6-dichlorophenolindophenol sodium salt hydrate （DCPIP）為Fluka公司產(chǎn)品，血清鐵測試盒為南京建成生物工程研究所提供，其余為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器：DSPT-202型動物跑臺 （中國杭州段氏制作），血紅蛋白計（瑞典B-Hemoglobin），YQ-3電動勻漿器 （江蘇金壇市儀表儀器廠），UNIVERSAL 32R臺式高速冷凍離心機（德國），UV754N紫外分光光度儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均用mean±SD表示，組間比較用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05時認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血清鐵及Hb含量（表2）

與C組相比，T組血清鐵含量顯著下降19.5%（P<0.01），S組血清鐵含量無顯著性變化，M組和L組血清鐵含量均顯著升高，分別升高19.3%（P<0.05）和34%（P<0.01）。 與T組相比，S組、M組和L組血清鐵含量均顯著升高（P<0.01），分別升高41.2%、47.9%和66.6%。

與C組相比，T組Hb含量顯著下降14.3%（P<0.01），S組、M組和L組均無顯著性變化。與T組相比，S組、M組和L組Hb含量均顯著升高（P<0.01），分別升高9.8%、27.2%和15.8%。

表2 各組大鼠血清鐵及Hb含量比較

2.2 骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅣ活性（表3）

與C組相比，T組、S組、M組和L組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ活性均顯著升高 （P<0.01），分別提高115.8%、50.5%、150.53%和39.43%，T組、S組和M組CⅡ活性均顯著升高 （P<0.01），分別提高82.11%、72.23%和133.38%，L組無顯著性變化；T組、S組、M組和L組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅢ活性均顯著提高（P<0.01），分別提高35.73%、165.9%、161.91%和36.75%；M組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅣ活性顯著提高43.07%（P<0.01），T組、S組和L組顯著下降（P<0.01），分別下降7.65%、37.52%和10.22%。

與T組相比，M組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ活性顯著提高16.09%（P<0.01），S組和L組均顯著下降（P<0.01），分別下降30.26%和35.39%；M組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅡ活性顯著提高28.15%（P<0.01），S組和L組均顯著下降 （P<0.01），分別下降5.43%和46.7%；S組和M組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅢ活性均顯著提高（P<0.01），分別提高95.9和92.96%，L組無顯著變化。M組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅣ活性顯著提高54.92%（P<0.01），S組和L組均顯著下降（P<0.01），分別下降32.34%和2.78%。

表3 各組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅣ活性比較（活性單位：nmol/min/mg protein）

3 討論

3.1 運動訓(xùn)練及補鐵對大鼠血清鐵含量的影響

研究顯示，長期遞增負荷跑臺運動導(dǎo)致大鼠血清鐵呈降低趨勢，營養(yǎng)干預(yù)后血清鐵顯著升高［3］。本研究結(jié)果顯示，大強度遞增負荷耐力訓(xùn)練大鼠血清鐵顯著降低，補鐵+訓(xùn)練組血清鐵含量均顯著高于訓(xùn)練大鼠。上述提示運動訓(xùn)練造成機體血清鐵含量低下，營養(yǎng)干預(yù)后改善血清鐵含量。

3.2 運動訓(xùn)練及補鐵對大鼠Hb含量的影響

有研究顯示，大運動量跑臺運動訓(xùn)練后，Hb含量顯著低于對照組［11，12］。 本研究結(jié)果顯示，訓(xùn)練組大鼠Hb含量顯著低于安靜對照組。這說明大強度耐力訓(xùn)練引起機體鐵缺失甚至缺鐵性貧血。其機制可能為，大強度耐力訓(xùn)練引起紅細胞破壞增加，鐵丟失增加，導(dǎo)致紅細胞數(shù)下降和血紅蛋白濃度降低，是機體對大負荷量運動訓(xùn)練的一種生理應(yīng)答。

本研究結(jié)果還顯示，大強度耐力訓(xùn)練期間適時補鐵提高Hb含量，且效應(yīng)為中劑量補鐵大于大劑量補鐵大于小劑量補鐵。說明大強度耐力訓(xùn)練復(fù)合補鐵改善運動性貧血狀況，中劑量補鐵效應(yīng)最佳。其可能機制是，大強度耐力訓(xùn)練使機體鐵代謝紊亂，血清鐵含量低下，骨髓紅細胞生成速度相對低于紅細胞的破碎速度，致使Hb含量降低；補鐵緩解了運動訓(xùn)練對鐵代謝的不利影響，提高紅細胞生成速度和Hb含量，從而改善機體運氧能力。

3.3 運動訓(xùn)練及補鐵對大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的影響

人體細胞95%ATP由線粒體呼吸鏈所產(chǎn)生。呼吸鏈主要由NADH-Q還原酶（CⅠ）、琥珀酸-Q還原酶（CⅡ）、細胞色素還原酶（CⅢ）和細胞色素氧化酶（CⅣ）四部分組成。CⅠ輔基有黃素單核苷酸（FMN）和Fe-S蛋白。CⅡ輔基有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、Fe-S蛋白和細胞色素b（Heme b）。CⅢ輔基有Heme b562、Heme b566、Heme c1和 Fe-S蛋 白 。 CⅣ 輔 基 有Heme a、Heme a3、CuA和CuB。 這些輔基都是電子載體，電子傳遞通過與酶分子結(jié)合的輔基完成。可見鐵在電子傳遞過程中起重要作用，鐵缺乏影響CⅠ～CⅣ活性及ATP生成，影響運動能力。

有研究表明，大鼠力竭性游泳后股四頭肌線粒體細胞色素c氧化酶活性顯著下降，丙二醛（MDA）含量顯著升高，提示機體內(nèi)源自由基濃度升高和脂質(zhì)過氧化水平顯著升高［13］，一次性力竭運動后，大鼠骨骼肌線粒體內(nèi)膜NADH-CoQ還原酶和ATP酶活性分別較安靜時下降34.2%和46.2%［14］，提示力竭運動導(dǎo)致骨骼肌線粒體呼吸鏈功能下降。本研究結(jié)果顯示，訓(xùn)練組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅢ活性顯著高于對照組，CⅣ活性顯著低于對照組。運動訓(xùn)練使骨骼肌線粒體對訓(xùn)練刺激產(chǎn)生了一定適應(yīng)，為適應(yīng)機體運動的需要，增加骨骼肌線粒體呼吸鏈還原酶CⅠ～CⅢ活性。運動訓(xùn)練提高了線粒體耗氧量，氧自由基產(chǎn)生增多，過氧化脂質(zhì)含量增高，損傷呼吸鏈氧化酶CⅣ，使其活性下降。分子氧可在電子傳遞鏈中途接受一個單電子，即氧的單電子還原生成超氧陰離子（O2·-），對CⅣ活性產(chǎn)生影響且具有損害性，最終影響ATP生成［15］。 此外，在能量代謝過程中，是否由于氧化還原勢能改變和膜表面正電效應(yīng)，造成電子傳遞的阻力增加［16］，從而使處于線粒體呼吸鏈末端的CⅣ活性下降？其機制有待進一步研究。

本研究結(jié)果還顯示，小劑量補鐵+訓(xùn)練組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅲ活性顯著高于對照組，CⅣ活性顯著低于對照組，中劑量補鐵+訓(xùn)練組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅣ活性顯著高于對照組；大劑量補鐵+訓(xùn)練組大鼠CⅠ和CⅢ活性顯著高于對照組，CⅡ活性無顯著變化，CⅣ活性顯著低于對照組。這表明運動訓(xùn)練聯(lián)合補鐵可保持或提高骨骼肌線粒體還原酶CⅠ～CⅢ活性，中劑量補鐵提高線粒體氧化酶CⅣ活性。大強度耐力訓(xùn)練導(dǎo)致機體鐵代謝紊亂，影響Hb和肌紅蛋白載氧功能、鐵相關(guān)酶活性、線粒體呼吸鏈電子傳遞過程及質(zhì)子泵出過程，進而影響機體能量供應(yīng)。補鐵改善機體鐵代謝，進而改善機體氧運輸功能、線粒體呼吸鏈電子傳遞過程及利用氧的能力。另外，本研究結(jié)果還顯示，運動訓(xùn)練期間聯(lián)合中劑量補鐵提高骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅣ活性，效果優(yōu)于小劑量和大劑量補鐵。這可能與小劑量的劑量不夠、大劑量導(dǎo)致機體鐵過載有關(guān)。這提示鐵在維持線粒體呼吸鏈功能時可能存在臨界水平。

4 總結(jié)

大強度耐力訓(xùn)練引起大鼠缺鐵性貧血，訓(xùn)練期間聯(lián)合補鐵改善運動性貧血，中劑量補鐵提高骨骼肌線粒體呼吸鏈功能效果好于小劑量和大劑量補鐵。

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