重組人生長(zhǎng)激素穩(wěn)定性研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：R944.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533-(2010)09-0414-03

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多肽類藥物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，相應(yīng)的制劑學(xué)研究也日益受到重視。與傳統(tǒng)小分子有機(jī)藥物相比，多肽具有穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短和生物膜透過性差等特點(diǎn)。在我國(guó)，重組人生長(zhǎng)激素主要用于兒童內(nèi)源性生長(zhǎng)激素缺乏引起的矮小癥、Turner綜合癥、成人GHD、燒傷及創(chuàng)傷的修復(fù)等治療。隨著臨床研究的深入，其在抗衰老、骨質(zhì)疏松和心血管疾病的治療方面亦顯示有很好的療效。近年來，重組人生長(zhǎng)激素相關(guān)研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一，研究范圍從工程菌培養(yǎng)、生產(chǎn)、發(fā)酵、純化、凍干，一直延伸到制劑的改良和穩(wěn)定性提高等。本文就重組人生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性研究進(jìn)展作一綜述。

1 人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)特性和生理作用

人生長(zhǎng)激素(hGH)是由腦垂體前葉分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素，含191個(gè)氨基酸殘基，分子量為22 KDa，有兩個(gè)二硫鍵，無糖基化，是人出生后促生長(zhǎng)的最重要激素，有很強(qiáng)的種屬特異性。hGH是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能影響幾乎所有的組織類型和細(xì)胞，甚至包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)，其主要作用是刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝。hGH發(fā)揮功能作用主要經(jīng)由兩個(gè)途徑：一是誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肌細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)激素介質(zhì)(somatomedin，SM)，再經(jīng)由SM間接起作用；二是直接作用于靶細(xì)胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無論何種途徑，hGH都需要首先同細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，再由受體介導(dǎo)，激發(fā)一系列生化反應(yīng)并最終產(chǎn)生生物效應(yīng)。hGH的基本功能是刺激所有機(jī)體組織的發(fā)育，增加體細(xì)胞的大小與數(shù)量，hGH的這種促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的基礎(chǔ)是促進(jìn)合成代謝。

2 引起重組人生長(zhǎng)激素不穩(wěn)定的因素及其物理、化學(xué)不穩(wěn)定性

重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)是一種不穩(wěn)定的蛋白藥物，暴露在生理環(huán)境中或與有機(jī)溶劑接觸易發(fā)生聚集，形成可溶性和不溶性的蛋白聚集體。一些物理因素如劇烈攪拌、冷凍干燥和射線輻照等也都會(huì)加速rhGH聚集。溫度和pH值是影響rhGH穩(wěn)定性的最重要的因素。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，很難總結(jié)出溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能影響的普遍機(jī)理。一般來說，溫度越高，穩(wěn)定性越差。蛋白質(zhì)和多肽都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于極端pH值時(shí)，分子間靜電排斥增加，引起蛋白質(zhì)折疊，這一過程會(huì)導(dǎo)致電荷密度降低，即降低靜電自由能。極端的pH值會(huì)降低鹽橋(salt bridge)的形成能力，這也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。此外，天然結(jié)構(gòu)與去折疊狀態(tài)內(nèi)帶電基團(tuán)的pKa值不同，pH值的改變會(huì)影響帶電基團(tuán)的性質(zhì)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。

多肽和蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性可以分為兩種情況，即物理不穩(wěn)定性和化學(xué)不穩(wěn)定性。最常見的物理不穩(wěn)定性是聚合。最常見的化學(xué)反應(yīng)包括以下幾種：1)脫酰胺反應(yīng)。在脫酰胺反應(yīng)中，Asn／Gin殘基水解形成Asp／Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)與環(huán)境條件和多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)，提高pH值、升高溫度都將有利于脫酰胺反應(yīng)的進(jìn)行。2)氧化。多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過氧化物的污染，二是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基中，Met、Cys和His、Trp和Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對(duì)氧化也都有影響。3)水解。多肽中的肽鍵易水解斷裂，由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂。4)形成錯(cuò)誤的二硫鍵。二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯(cuò)誤的二硫鍵，導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)改變和活性喪失。5)消旋。除Gly外，所有氨基酸殘基的(3C碳原子都是手性的，易在堿催化下發(fā)生消旋反應(yīng)。6)β消除。β消除是指氨基酸殘基中β碳原子上基團(tuán)的消除。Cys、Set、Thr、Phe和TYr等殘基都可通過消除降解。在堿性pH下易發(fā)生B消除，溫度和金屬離子對(duì)其也有影響。

3 提高重組人生長(zhǎng)激素穩(wěn)定性的途徑

3.1 化學(xué)修飾

目前研究最多的是聚乙二醇(PEG)修飾。PEG是一種水溶性高分子化合物，在體內(nèi)可降解，無毒。PEG與多肽結(jié)合后能提高熱穩(wěn)定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可保持或提高原生物活性。通過高效液相色譜法(HPLC)可對(duì)修飾結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.2 使用添加劑

穩(wěn)定蛋白質(zhì)類藥物常加入的輔料有糖類、多元醇、表面活性劑、鹽、氨基酸和大分子化合物等。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周圍，從而提高多肽的穩(wěn)定性；表面活性劑可降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力，抑制蛋白質(zhì)在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附或阻止蛋白質(zhì)的化學(xué)降解；鹽類可以起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，也可以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這主要取決于鹽的種類、濃度、離子相互作用的性質(zhì)及蛋白質(zhì)的電荷；一些氨基酸單獨(dú)或與其它輔料并用，通過優(yōu)先排除機(jī)制穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在凍干過程中，上述物質(zhì)還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象，而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度；大分子化合物穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機(jī)制可能包括大分子的表面活性、優(yōu)先排除、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的空間隱蔽度提高、限制蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)及優(yōu)先吸附等。白蛋白(HSA)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)常用的大分子物質(zhì)，羥丙基β-環(huán)糊精(HP-p-CD)也是較有前途的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。

此外，一些二價(jià)金屬離子如鈣、鎂、鋅和鈷等通過配位作用容易與蛋白質(zhì)結(jié)合，使整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊實(shí)和穩(wěn)定，從而使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。使用不同的測(cè)試手段，如熱力學(xué)法和凝膠法可測(cè)試金屬離子和生長(zhǎng)激素的結(jié)合部位。生長(zhǎng)激素中的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基可能是生長(zhǎng)激素中的金屬結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于金屬離子對(duì)生長(zhǎng)激素的影響可采用多種方法從不同角度去測(cè)量，如用差熱法去檢測(cè)鈣離子對(duì)重組人生長(zhǎng)激素的影響，用熱穩(wěn)定性檢測(cè)鎂離子對(duì)于生長(zhǎng)激素的作用，測(cè)試鈷離子的金屬鍵對(duì)生長(zhǎng)激素的影響”等。結(jié)果表明，金屬離子確實(shí)使生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性有所提高，但是其反應(yīng)的機(jī)理和過程尚不明確，而且，對(duì)于測(cè)量方法也沒有最佳的評(píng)價(jià)方法，每個(gè)方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

3.3 其它

多肽發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)如脫酰胺、消除和水解等都需要水參與，水含量降低還可使多肽的變性溫度升高，因此，使用凍干技術(shù)可提高多肽的穩(wěn)定性。此外，通過使用生物降解材料，如聚乙交酯－丙交酯、乳酸羥基乙酸共聚物等制備重組人生長(zhǎng)激素微球可達(dá)到較好的釋放效果并提高其穩(wěn)定性。通過基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘基可提高多肽的穩(wěn)定性。

4 重組人生長(zhǎng)激素的分析檢測(cè)

rhGH屬于多肽類藥物的一種，其檢測(cè)方法與多肽類藥物相同。常用方法主要有高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(HPCE)、質(zhì)譜、凝膠電泳等法。檢測(cè)目的主要包括等電點(diǎn)測(cè)定(CIEF技術(shù))、分子量測(cè)定(SDS—PAGE和SDS—CGE)、穩(wěn)定性研究(HPCE輔以基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法)、氨基酸組成分析(Edman酶解、化學(xué)降解法或直接多肽特異酶解后經(jīng)HPCE和HPLC分離進(jìn)入氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行序列測(cè)定)以及結(jié)構(gòu)分析(質(zhì)譜、核磁共振、傅立葉紅外轉(zhuǎn)換光譜、圓二柱色譜)等。

4.1 高效液相色譜

HPLC法是檢測(cè)多肽組分含量、純度最常用和最成熟的一種方法。其中，反相色譜柱對(duì)多肽類藥物的分析占高效液相色譜分析的80％以上。

4.2 毛細(xì)管電泳

HPCE主要用于多肽純度的鑒定。與HPLC法相比，HPCE具有更高的分辨率和靈敏度，某些純化的多肽在凝膠電泳和HPLC上鑒定純度為100％，但用HPCE分析純度僅90％。同時(shí)，HPCE法的進(jìn)樣量也更少。

4.3 DSC熱差分析儀

使用熱差分析儀可對(duì)蛋白質(zhì)藥物的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

4.4 快原子轟擊質(zhì)譜

快原子轟擊質(zhì)譜是準(zhǔn)確測(cè)定多肽物質(zhì)分子量的有效方法。由于不易獲得碎片峰，其在測(cè)定多肽順序上有困難，應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜可解決這一問題。通過快原子轟擊質(zhì)譜確定多肽分子量，在此基礎(chǔ)上通過活化碰撞(CA)技術(shù)可對(duì)氨基酸序列進(jìn)行識(shí)別。

4.5 電噴霧電離質(zhì)譜

電噴霧電離質(zhì)譜依靠強(qiáng)電場(chǎng)使分子電離。電噴霧技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，不僅能測(cè)定生物分子的分子量，而且能確定多肽和蛋白質(zhì)的序列信息。

4.6 基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、質(zhì)量分辨率高和測(cè)定質(zhì)量范圍寬等特點(diǎn)，非常適合生物分子和高聚物的分子量測(cè)定。

4.7 核磁共振

核磁共振(NMR)可用于確定氨基酸序列，并可對(duì)混合物中的各組分含量進(jìn)行分析。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，對(duì)rhGH的研究主要集中在劑型的改良和穩(wěn)定性研究上。隨著科技的進(jìn)步，更加精密的檢測(cè)儀器的出現(xiàn)必將加速這一研究進(jìn)程。未來研究方向可以分為幾個(gè)方面：1)聚乙二醇化rhGH的制備、純化、理化性質(zhì)以及生物活性研究；2)金屬離子穩(wěn)定rhGH機(jī)理的研究；3)rhGH液體制劑的開發(fā)和穩(wěn)定性研究；4)采用生物可降解材料開發(fā)rhGH控釋、緩釋劑型的研究。