小蓬草精油化感作用的生物測定

劉姍姍，王海英，①，劉志明

植物精油（essentialoil）是由一種或多種具有香氣特征的揮發(fā)性化合物組成的混合物，為植物次生代謝的部分產(chǎn)物，一般都具有抑菌、殺蟲和抗氧化等活性，主要應(yīng)用于食品、煙酒、香水、護(hù)膚品、護(hù)發(fā)品和洗滌用品等的賦香，也常應(yīng)用于抗菌劑和殺蟲劑等的開發(fā)。Tworkoski[1]的研究結(jié)果表明，錫蘭肉桂（CinnamomumzeylanicumBl.）精油具有較強(qiáng)的除草活性，該精油的主要成分是丁香酚（eugeno l）。植物次生代謝產(chǎn)生的具有影響（抑制或促進(jìn)）其他植物生長作用的化感物質(zhì)（allelochem icals）在自然狀況下主要以4種方式進(jìn)入周圍環(huán)境：1）通過根系分泌物；2）植物體內(nèi)由莖、葉產(chǎn)生的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)；3）植物地上部分受雨、霧及露水淋洗的化學(xué)物質(zhì)；4）微生物分解植物殘?bào)w并釋放到土壤里的化學(xué)物質(zhì)。以植物次生代謝產(chǎn)生的化感物質(zhì)為模板合成新型環(huán)境友好型除草劑是當(dāng)今除草劑研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[2-4]。

小蓬草〔Conyzacanadensis（L.）C ronq.〕是菊科（Compositae）白酒草屬（ConyzaLess.）一年生草本植物，別名加拿大蓬、飛蓬或小飛蓬；小蓬草為芳香植物，全草含精油，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)廣泛分布于世界各地；夏、秋季形成單種優(yōu)勢群落，影響其他本土植物的生長，在許多地區(qū)已被列入外來入侵植物名錄[5-8]。許桂芳等[9]的研究結(jié)果表明，小蓬草具有化感作用，其新鮮莖葉的水浸提液（含酚類物質(zhì)）對(duì)小麥（TriticumaestivumL.）種子萌發(fā)和幼苗生長均具有抑制作用。高興祥等[10-12]的研究結(jié)果表明，根系分泌是小蓬草化感物質(zhì)釋放的主要途徑之一，其提取物具有除草等生物活性。曹慕嵐等[13]的研究結(jié)果表明，小蓬草地上部分和地下部分水浸提液對(duì)水稻（Oryza sativaL.）和油菜（BrassicacampestrisL.）種子的最終萌發(fā)及根長生長均具有抑制作用。

作者采用水蒸氣蒸餾法從小蓬草地上部分（包括莖、葉、花等）提取得到精油，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)（GC-MS）對(duì)小蓬草精油的化學(xué)組成進(jìn)行分析，并以小麥、青菜（B.chinensisL.）、白菜〔B.pekinensis（Lour.）Rup r.〕和高粱〔Sorghumbicolor（L.）Moench〕為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用Weiss紙上種子發(fā)芽測定標(biāo)準(zhǔn)方法（培養(yǎng)皿法）[14]對(duì)小蓬草精油的化感活性進(jìn)行生物測定，從入侵生物學(xué)角度探討小蓬草精油的化感潛力、研究小蓬草的化感作用，以期尋找新穎的除草活性先導(dǎo)化合物（化感物質(zhì)），為小蓬草的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用野生小蓬草地上部分于2009年7月下旬采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范基地，并經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林植物資源學(xué)植物標(biāo)本室穆立薔教授鑒定。青菜、白菜、小麥和高粱種子均購自哈爾濱市種子市場。

1.2 方法

1.2.1 精油提取方法 稱取140 g小蓬草新鮮地上部分，剪成1～2 cm小段，用水蒸氣蒸餾法提取3 h，提取液用20mL乙醚進(jìn)行萃取，向乙醚相中加入適量無水Na2SO4干燥15m in，過濾后置于40℃水浴中去除乙醚，得到淺黃色油狀物，即為小蓬草精油。

1.2.2 精油 GC-MS分析方法 用甲醇（色譜純）將上述小蓬草精油配制成質(zhì)量濃度0.04 g·mL-1的甲醇溶液，利用 GC-MS6890N-5973 insert氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國 Agilent公司生產(chǎn)）進(jìn)行 GCMS分析。

氣相色譜分析條件：色譜柱為DB-17MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），檢測器為 FID檢測器。初始溫度40℃，保持4m in；以5℃·m in-1的升溫速率升溫至110℃，保持5m in；以5℃·m in-1的升溫速率升溫至250℃，保持5 m in。進(jìn)樣口溫度260℃；進(jìn)樣量1.0μL，不分流；載氣為氦氣；流速1mL·m in-1。

質(zhì)譜分析條件：EI離子源，接口溫度280℃，離子源溫度230℃，轟擊電壓70 eV，相對(duì)分子質(zhì)量掃描范圍15～260 am u。

1.2.3 生物測定方法 用丙酮將小蓬草精油配制成質(zhì)量濃度為6.0 g·L-1的小蓬草精油丙酮溶液，然后采用半量稀釋法用丙酮稀釋成質(zhì)量濃度分別為3.0、1.5和0.75 g·L-1的小蓬草精油丙酮溶液。參照文獻(xiàn)[12，14-15]的方法進(jìn)行化感活性的生物檢測。

在已消毒的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入1mL質(zhì)量濃度為6.0、3.0、1.5和0.75 g·L-1的小蓬草精油丙酮溶液和5mL蒸餾水，對(duì)照則加入1mL丙酮和5mL蒸餾水，混合均勻后鋪入2層濾紙，待濾紙浸濕后將籽粒飽滿、大小均勻的青菜、白菜、小麥和高粱種子各10粒分別在濾紙上水平擺成1行，蓋上培養(yǎng)皿蓋；將培養(yǎng)皿置于 HPG-400HX人工氣候箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造）內(nèi)并傾斜30°放置，于（25±1）℃、黑暗條件下培養(yǎng)4 d后，從第5天開始進(jìn)行連續(xù)光照（光照度5000 lx，光照時(shí)間24 h·d-1）培養(yǎng)。各處理均設(shè)3次重復(fù)。

以胚根或胚軸突破種皮1～2mm作為種子發(fā)芽的判定標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察并記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7d，計(jì)算最終發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)；并于第7天用數(shù)碼顯示游標(biāo)卡尺測量幼苗的根長（胚軸末端至根末端的長度）和株高（胚軸頂端至幼苗頂端的長度），其中，青菜和白菜測量主根長度，小麥和高粱則測量最長根的長度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

小蓬草精油的氣相色譜-質(zhì)譜的總離子流色譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫自動(dòng)檢索、解析和部分化合物的人工解析確定其組成成分，并通過峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

參照文獻(xiàn) [13，16-17]計(jì)算種子的萌發(fā)指標(biāo)。最終發(fā)芽率 =（前7天發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)）×100％；發(fā)芽指數(shù)Rg=∑Gt/Dt，式中，Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為與Dt相對(duì)應(yīng)的當(dāng)天發(fā)芽種子數(shù)。

化感效應(yīng)敏感指數(shù)（Ri）計(jì)算公式為：若T≥C，則Ri=1-C/T；若T＜C，則Ri=T/C-1。式中，Ri表示化感作用強(qiáng)度大小，其絕對(duì)值的大小反映化感作用的強(qiáng)弱；C和T分別為各供試植物種子的最終發(fā)芽率、種子發(fā)芽指數(shù)以及根長和株高的對(duì)照值和處理值。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行處理，并進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 小蓬草精油的主要化學(xué)組分及其相對(duì)含量

采用水蒸氣蒸餾法從小蓬草地上部分提取得到精油，提取率為0.07％；從該精油中共分離出11種化學(xué)成分，已鑒定出其中的5種成分，這5種成分的相對(duì)含量見表1。小蓬草精油中保留時(shí)間為35.763 m in的成分含量最高（相對(duì)含量54.41％），其質(zhì)譜（m/z）數(shù)據(jù)為15、27、39、51、63、77、89、103、115、131、143、159和174，且自動(dòng)檢索匹配度低。經(jīng)由人工解析可知，m/z15、27、39、51、63和77表明該化合物含苯基；m/z89表明苯基上有1個(gè)含碳的取代基[18-20]；根據(jù)質(zhì)量差規(guī)律[21]判斷m/z174為分子離子峰，相對(duì)分子質(zhì)量為174。結(jié)合計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫自動(dòng)檢索結(jié)果，初步判定該化合物為2，3-二甲基-4（3H）-喹唑啉酮。

小蓬草精油中還含有α-姜黃烯和2種萜烯類化合物（α-佛手柑油烯和反式-β-金合歡烯）以及1種醇類化合物（檸檬烯二醇）。有研究表明，萜烯類化合物、酚類化合物、直鏈醇、脂肪族醛和酮等都具有一定的化感作用[22-25]，基于此，作者將針對(duì)小蓬草精油的化感活性開展相應(yīng)的研究。

表1 小蓬草精油的主要化學(xué)成分及其相對(duì)含量Table1 Ma in chem ica l com ponen ts and their rela tive con ten ts in essen tia lo il from Conyza canadensis（L.）C ronq.

2.2 小蓬草精油的化感活性

2.2.1 對(duì)種子發(fā)芽率的影響 不同質(zhì)量濃度小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱種子最終發(fā)芽率的影響及其化感效應(yīng)敏感指數(shù)見表2。從4種植物種子的最終發(fā)芽率（表2）可以看出，質(zhì)量濃度1.5、3.0和6.0 g·L-1小蓬草精油具有降低青菜、白菜、小麥和高粱種子最終發(fā)芽率的作用，隨著精油質(zhì)量濃度的提高植物種子的最終發(fā)芽率不斷降低。在供試的4種植物中，青菜種子對(duì)小蓬草精油最為敏感，精油濃度為6.0g·L-1時(shí)最終發(fā)芽率最低，僅為3％，且極顯著低于其他處理組及對(duì)照組；在3.0和1.5 g·L-1小蓬草精油處理組中，青菜種子的最終發(fā)芽率相近且差異不顯著，但均極顯著低于對(duì)照和0.75 g·L-1處理組、極顯著高于6.0 g·L-1處理組。3.0和6.0 g·L-1處理組白菜種子的最終發(fā)芽率極顯著低于對(duì)照；6.0 g·L-1處理組小麥和高粱種子的最終發(fā)芽率分別極顯著或顯著低于對(duì)照。總體上看，0.75 g·L-1小蓬草精油對(duì)4種植物種子的最終發(fā)芽率沒有影響，而6.0 g·L-1小蓬草精油對(duì)4種植物種子的最終發(fā)芽率均有極顯著或顯著的影響。

從表2還可以看出，6.0、3.0和1.5 g·L-1處理組4種植物種子最終發(fā)芽率的化感效應(yīng)敏感指數(shù)均為負(fù)值，說明一定質(zhì)量濃度的小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱種子發(fā)芽均有抑制作用。隨著小蓬草精油質(zhì)量濃度的提高，4種植物種子最終發(fā)芽率的化感效應(yīng)敏感指數(shù)絕對(duì)值逐漸增大，表明小蓬草精油質(zhì)量濃度越高，其對(duì)植物種子萌發(fā)的抑制作用越大。在供試的4種植物中，各處理組青菜種子最終發(fā)芽率的化感效應(yīng)敏感指數(shù)的絕對(duì)值均最大，根據(jù)表2數(shù)據(jù)推測，小蓬草精油對(duì)青菜種子萌發(fā)的半抑制濃度（IC50）為3.0 g·L-1。

表2 小蓬草精油對(duì)4種植物種子最終發(fā)芽率的影響及化感效應(yīng)敏感指數(shù)1）Table2 Effect of essen tia l o il from Conyza canadensis（L.）C ronq.on seed fina l germ ina tion ra te of four spec ies and a llelopa th ic effect index1）

2.2.2 對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)的影響 一般來說，種子發(fā)芽指數(shù)從置床開始算起，發(fā)芽指數(shù)越高說明該種子發(fā)芽所用的時(shí)間越短，發(fā)芽速率越快。經(jīng)不同質(zhì)量濃度小蓬草精油培養(yǎng)后4種植物的種子發(fā)芽指數(shù)及其化感效應(yīng)敏感指數(shù)見表3。由表3可以看出，各處理組青菜、白菜、小麥和高粱種子的發(fā)芽指數(shù)均低于對(duì)照，說明小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱種子的發(fā)芽速率均有一定的抑制作用。隨精油質(zhì)量濃度的提高，4種供試植物的種子發(fā)芽指數(shù)不斷降低；其中，6.0g·L-1處理組4種植物種子的發(fā)芽指數(shù)均最低，與對(duì)照均有極顯著差異，也低于其他質(zhì)量濃度處理組；而0.75 g·L-1處理組4種植物種子的發(fā)芽指數(shù)雖然也低于對(duì)照組，但無顯著差異。在供試的4種植物中，青菜種子的發(fā)芽指數(shù)對(duì)小蓬草精油最為敏感，6.0g·L-1處理組青菜種子的發(fā)芽指數(shù)最低，僅為0.11，與其他處理組及對(duì)照組有極顯著差異；精油濃度為1.5和3.0 g·L-1的處理組青菜種子發(fā)芽指數(shù)極顯著低于對(duì)照和0.75 g·L-1處理組、極顯著高于6.0g·L-1處理組。3.0 g·L-1處理組白菜、小麥和高粱種子的發(fā)芽指數(shù)均極顯著或顯著低于對(duì)照；而1.5 g·L-1處理組白菜、小麥和高粱種子的發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照差異不顯著。

從表3還可以看出，各處理組青菜、白菜、小麥和高粱種子發(fā)芽指數(shù)的化感效應(yīng)敏感指數(shù)均為負(fù)值，說明小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱種子的發(fā)芽速率均有抑制作用。隨精油質(zhì)量濃度的提高，4種供試植物種子發(fā)芽指數(shù)的化感效應(yīng)敏感指數(shù)絕對(duì)值不斷增大，說明小蓬草精油對(duì)4種植物種子發(fā)芽速率的抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2.2.3 對(duì)幼苗根長的影響 不同質(zhì)量濃度小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱幼苗根長的影響及其化感效應(yīng)敏感指數(shù)見表4。由表4可以看出，各處理組青菜、白菜、小麥和高粱幼苗的根長均低于對(duì)照，說明小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱幼苗根長的生長有一定的抑制作用。隨精油質(zhì)量濃度的提高，4種植物幼苗的根長不斷減小，其中，6.0 g·L-1小蓬草精油對(duì)根長的抑制作用最明顯，該處理組4種植物幼苗的根長均極顯著低于對(duì)照；而0.75 g·L-1處理組4種植物幼苗的根長雖然也小于對(duì)照，但總體上差異不明顯。供試的4種植物幼苗根長生長對(duì)小蓬草精油的敏感性有一定的差異，其中青菜和高粱幼苗根長生長對(duì)小蓬草精油較為敏感，6.0 g·L-1處理組青菜和高粱幼苗的根長分別僅為對(duì)照的3.61％和3.69％。經(jīng)過不同質(zhì)量濃度小蓬草精油處理后，4種植物幼苗根長生長的變化也有不同，其中，1.5 g·L-1處理組青菜幼苗的根長極顯著低于對(duì)照組和0.75 g·L-1處理組、極顯著高于3.0和6.0 g·L-1處理組；3.0 g· L-1處理組白菜幼苗的根長與對(duì)照組有極顯著差異；各處理組小麥幼苗的根長與對(duì)照組均有顯著或極顯著差異；1.5 g·L-1處理組高粱幼苗的根長極顯著低于對(duì)照組和0.75 g·L-1處理組 、顯著高于3.0和6.0 g·L-1處理組。

由表4還可見，小蓬草精油各處理組4種供試植物幼苗根長的化感效應(yīng)敏感指數(shù)均為負(fù)值，且其絕對(duì)值隨著精油質(zhì)量濃度的提高不斷增大，說明不同質(zhì)量濃度小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱幼苗根長的生長均有一定的抑制作用，且精油質(zhì)量濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

表3 小蓬草精油對(duì)4種植物種子發(fā)芽指數(shù)的影響及化感效應(yīng)敏感指數(shù)1）Table3 Effect of essen tia lo il from Conyza canadensis（L.）C ronq.on seed germ ina tion index of four speciesand a llelopa th ic effect index1）

表4 小蓬草精油對(duì)4種植物幼苗根長的影響及化感效應(yīng)敏感指數(shù)1）Table4 Effect of essen tia lo il from Conyza canadensis（L.）C ronq.on seed ling root length of four speciesand a llelopa th ic effect index1）

2.2.4 對(duì)幼苗株高的影響 不同質(zhì)量濃度小蓬草精油對(duì)4種供試植物幼苗株高的影響及其化感效應(yīng)敏感指數(shù)見表5。由表5可以看出，各處理組青菜、白菜、小麥和高粱幼苗的株高均小于對(duì)照，且隨精油質(zhì)量濃度的提高，幼苗株高不斷降低，說明小蓬草精油對(duì)4種供試植物幼苗株高的生長均有一定的抑制作用，且抑制作用的強(qiáng)度與精油的質(zhì)量濃度有一定的相關(guān)性。

4種供試植物中，青菜幼苗的株高生長對(duì)小蓬草精油的敏感性最弱，僅6.0 g·L-1處理組青菜幼苗的株高極顯著小于對(duì)照，其他處理組青菜幼苗的株高均與對(duì)照組無顯著差異；白菜幼苗的株高生長對(duì)小蓬草精油的敏感性也較弱，僅3.0和6.0 g·L-1處理組白菜幼苗株高與對(duì)照組有極顯著差異；小麥和高粱幼苗的株高生長對(duì)小蓬草精油的敏感性相對(duì)較強(qiáng)，其中，0.75 g·L-1處理組小麥幼苗的株高與對(duì)照組有顯著差異，1.5 g·L-1處理組高粱幼苗的株高與對(duì)照組有顯著差異。

表5 小蓬草精油對(duì)4種植物幼苗株高的影響及化感效應(yīng)敏感指數(shù)1）Table5 Effect of essen tia lo il from Conyza canadensis（L.）C ronq.on seed ling heigh t of four speciesand a llelopa th ic effect index1）

由表5還可見，小蓬草精油不同質(zhì)量濃度處理組青菜、白菜、小麥和高粱幼苗株高的化感效應(yīng)敏感指數(shù)均為負(fù)值，并隨質(zhì)量濃度的提高，化感效應(yīng)敏感指數(shù)的絕對(duì)值逐漸增大，說明小蓬草精油對(duì)青菜、白菜、小麥和高粱幼苗株高的生長均有抑制作用，且抑制作用的強(qiáng)度與精油的質(zhì)量濃度有一定的相關(guān)性。小蓬草精油對(duì)4種植物幼苗株高的這種化感效應(yīng)與其對(duì)4種植物種子的最終發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和幼苗根長的化感效應(yīng)規(guī)律一致。

3 討論和結(jié)論

生物測定結(jié)果顯示，經(jīng)小蓬草精油處理后青菜、白菜、小麥和高粱種子的最終發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)以及幼苗的根長和株高總體上均低于對(duì)照，且各指標(biāo)均隨小蓬草精油質(zhì)量濃度的提高不斷下降，其中，在低質(zhì)量濃度（0.75 g·L-1）小蓬草精油影響下4個(gè)生物測定指標(biāo)基本上與對(duì)照無顯著差異，而在高質(zhì)量濃度（6.0 g·L-1）小蓬草精油影響下4個(gè)生物測定指標(biāo)均與對(duì)照有顯著或極顯著的差異，說明小蓬草精油對(duì)4種供試植物的種子萌發(fā)和幼苗生長均有一定的化感作用，且這種化感作用因化感成分質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。這與同為菊科外來植物的牛膝菊（Galinsoga parvifloraCav.）和野茼蒿〔Crassocephalumcrepidioides（Benth.）S.Moore〕等種類對(duì)部分作物化感作用的研究結(jié)果[26]相似。不同質(zhì)量濃度小蓬草精油對(duì)4種供試植物4個(gè)生物測定指標(biāo)的化感效應(yīng)敏感指數(shù)有一定的差異，但總體上均為負(fù)值，且隨小蓬草精油質(zhì)量濃度的提高，各指標(biāo)化感效應(yīng)敏感指數(shù)的絕對(duì)值均逐漸增大，表明小蓬草精油對(duì)4種供試植物的化感作用均為抑制作用，且這種抑制作用的強(qiáng)度與小蓬草精油的質(zhì)量濃度相關(guān)。不同質(zhì)量濃度小蓬草精油對(duì)供試4種植物的化感作用的強(qiáng)弱因植物種類及測定指標(biāo)的不同而異，其中，小蓬草精油對(duì)青菜種子最終發(fā)芽率具有明顯的抑制作用，并主要通過影響青菜種子的發(fā)芽速率抑制青菜種子萌發(fā)，表明青菜種子最終發(fā)芽率對(duì)小蓬草精油化感作用的敏感性最強(qiáng)，其半抑制濃度（IC50）約為3.0 g·L-1。在同一供試植物的不同測定指標(biāo)中，小蓬草精油對(duì)種子的發(fā)芽指數(shù)與最終發(fā)芽率的抑制效果較一致，但相對(duì)而言種子最終發(fā)芽率更為敏感；幼苗根長生長對(duì)小蓬草精油化感作用的敏感性高于株高生長，也即小蓬草精油對(duì)供試植物幼苗根長生長的抑制作用大于對(duì)幼苗地上部分生長的抑制作用，從這一角度來看，小蓬草精油可作為植物源除草劑原料進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)利用研究。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果顯示：小蓬草精油中主要含有2，3-二甲基-4（3H）-喹唑啉酮、α-佛手柑油烯和反式-β-金合歡烯等酮類化合物和萜烯類化合物，這些成分均為具有一定化感活性的次生代謝產(chǎn)物，因而，這也可能是小蓬草在夏、秋季能形成單種優(yōu)勢群落并影響其他本土植物的生長從而成為入侵植物的原因之一。在小蓬草精油的化感作用中究竟是單一化感成分作用還是幾種化感成分共同作用，其化感機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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