菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲的生物活性

孫孌姿，呼天明，王佺珍，①，崔 健，杜金鴻

目前，中國的植物源農(nóng)藥研究和開發(fā)與國際上同類研究相比還有較大的差距[1]。隨著人們對食品安全、環(huán)境保護和克服有害生物抗性等問題的日益重視，化學殺菌劑的使用正受到越來越嚴格的限制[2]；而現(xiàn)有的各種殺蟲和驅(qū)蟲農(nóng)藥也均有一定程度的毒性和副作用，已引起了人們的關(guān)注。研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物對大多數(shù)昆蟲有顯著的抗生作用，而且不同寄主植物與昆蟲的生長發(fā)育也有很大關(guān)系[3-5]。這些研究結(jié)果為生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)，目前關(guān)于不同種類植物提取物的殺蟲和抑菌活性已有許多的研究報道[6-14]?；谀壳盃顩r，從天然產(chǎn)物中篩選出高活性物質(zhì)，并以其為模板合成新型綠色農(nóng)藥，或直接將其開發(fā)為高效、低毒、低殘留、環(huán)境友好型的天然源綠色農(nóng)藥制劑，亦或用純植物天然產(chǎn)物驅(qū)蟲劑和殺菌劑替代傳統(tǒng)農(nóng)藥以減少環(huán)境污染，已是當務(wù)之急，勢在必行。

菊苣（CichoriumintybusL.）為菊科（Compositae）菊苣屬（CichoriumL.）多年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲、西亞、中亞和北美洲，中國的西北、華北及東北等地區(qū)均有分布，是藥食兩用植物，具有較高的經(jīng)濟價值。栽培菊苣具有抗病蟲害、產(chǎn)量高、再生能力強等特點[15-18]，是具有深度開發(fā)潛力的植物物種之一。菊苣是維吾爾族和蒙古族習用藥材[19]，具有增強免疫能力、抗炎、降低膽固醇及降血糖等功效[20-21]，國外也有關(guān)于菊苣藥用功效方面的研究報道[22]。菊苣天然提取物所含的化學成分類型較多，主要有倍半萜內(nèi)酯類、二萜類、倍半萜類、單萜類、黃酮類、香豆素類和甾醇類等成分[23]，多變的結(jié)構(gòu)類型和空間構(gòu)型使該植物的提取物呈現(xiàn)廣泛的生物活性。藥理藥效研究結(jié)果表明，菊苣有機溶劑提取物具有顯著的細胞毒性和較強的殺蟲和驅(qū)蟲作用[24]。因而，利用菊苣天然產(chǎn)物提取物開發(fā)綠色驅(qū)蟲劑，既能保護生態(tài)又無環(huán)境污染，也不存在資源短缺的問題。然而，至今未見有關(guān)菊苣葉片提取物對農(nóng)業(yè)害蟲防治方面的研究報道。

作者選用乙酸乙酯、乙醚和石油醚3種有機溶劑，采用冷浸和超聲波提取相結(jié)合的方法提取菊苣葉片的活性成分，并以粘蟲（MythimnaseparataWalker）為試蟲，對菊苣葉片不同溶劑提取物的生物活性進行了測定，以期為菊苣的深度開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菊苣新鮮葉片采自陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學牧草試驗田。將葉片置于室內(nèi)陰干后，用 DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海益恒科技儀器有限公司制造）于（40±1）℃的條件下干燥至發(fā)脆；然后用微型植物試樣粉碎機粉碎，過40目篩，于密封塑料袋中保存、備用。

供試粘蟲由西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究中心提供。粘蟲幼蟲于光照時間14 h·d-1、溫度（27±1）℃、相對濕度（80±5）％的條件下用人工飼料喂養(yǎng)，選取同一世代、3日齡的健康幼蟲供試。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備方法 采用冷浸和超聲波提取相結(jié)合的方法[2]進行提取。稱取3份干粉（質(zhì)量均為50 g），分別置于1000mL棕色瓶中，各加入10倍量的乙酸乙酯、乙醚或石油醚，浸泡24 h后超聲波提取20m in，過濾；濾渣重復提取1次，過濾；合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀，稱取質(zhì)量并計算得率。各提取物浸膏分別用丙酮溶解并定容至50mL（1mL丙酮溶液相當于1 g菊苣葉片干粉），即為各溶劑提取物的供試溶液，于4℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 生物活性測定方法

1.2.2.1 毒殺活性測定方法 采用飼喂稱重法[8]測定菊苣不同溶劑提取物對粘蟲生長發(fā)育的影響。取不同溶劑提取物的丙酮溶液各2.5mL，對照組則取丙酮2.5m L，分別與100 g人工飼料均勻混合，配制成不同的處理飼料，置于0℃～4℃冰箱內(nèi)備用。在培養(yǎng)皿中分別放置適量的處理飼料，每皿放入3日齡粘蟲幼蟲1頭，然后置于溫度（27±1）℃、相對濕度（80±5）％、光照時間14 h·d-1的培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)；2 d換1次飼料，5 d后更換正常飼料飼養(yǎng)。每處理30頭幼蟲，各重復3次。詳細觀察記錄對照組和處理組試蟲的生長和存活情況；定期（培養(yǎng)的第1、第3、第5、第7和第9天）稱量試蟲的個體質(zhì)量，直至試蟲化蛹為止；計算并統(tǒng)計化蛹率和死亡率。

1.2.2.2 非選擇性拒食作用測定方法 采用葉碟法進行測定[25]。將新鮮的玉米葉片剪成面積1 cm×2 cm的葉碟，分別在提取物質(zhì)量濃度為0.2 g·mL-1的各供試溶液內(nèi)浸泡2～3 s，對照則在丙酮中浸泡2～3 s，自然晾干后供試。在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿底部鋪1層濾紙，加水潤濕，選取大小一致、健壯并已饑餓4 h的粘蟲3齡幼蟲，每個培養(yǎng)皿中放1頭；在每個培養(yǎng)皿內(nèi)加1片葉碟，待試蟲吃完后再加1片葉碟。每處理10頭試蟲，各設(shè)3次重復。記錄試蟲取食葉碟的數(shù)量，每隔24 h用方格紙測定剩余葉碟的面積，并更換新鮮葉碟，連續(xù)觀察72 h，計算拒食率。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計

按照以下公式計算菊苣葉片不同溶劑提取物的得率以及粘蟲的死亡率、校正死亡率、發(fā)育抑制率和拒食率。提取物得率 =（某溶劑提取物的浸膏質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100％；死亡率 =（死亡蟲數(shù)/試蟲總數(shù)） ×100％；校正死亡率 =〔（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）〕×100％；發(fā)育抑制率 =〔（對照組試蟲個體質(zhì)量的增加量-處理組試蟲個體質(zhì)量的增加量）/對照組試蟲個體質(zhì)量的增加量〕×100％；拒食率 =〔（對照組平均取食葉碟面積-處理組平均取食葉碟面積）/對照組平均取食葉碟面積〕×100％。

采用 SAS及 Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，并采用Duncan’s新復極差法對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 菊苣葉片不同溶劑提取物得率的比較

經(jīng)過稱量和計算，菊苣葉片乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物的得率分別為4.36％、1.96％和1.08％。其中，乙酸乙酯提取物的得率最高，顯著高于乙醚和石油醚提取物的得率（P＜0.05），但乙醚和石油醚提取物的得率差異不顯著。

2.2 菊芋葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲生長發(fā)育的影響

2.2.1 對粘蟲幼蟲個體質(zhì)量的影響 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲個體質(zhì)量的影響見表1。由表1可見，在同一飼養(yǎng)期內(nèi)，用混合了菊苣葉片不同溶劑提取物的混合飼料飼喂的粘蟲幼蟲的個體質(zhì)量均顯著低于對照（P＜0.05）。在飼養(yǎng)的第1天，各處理組試蟲的個體質(zhì)量與對照組間的差異均達到顯著水平，但乙酸乙酯提取物處理組的個體質(zhì)量與石油醚和乙醚提取物處理組之間的差異不顯著，且乙酸乙酯提取物處理組的個體質(zhì)量略高于乙醚提取物處理組；在飼養(yǎng)的第3至第9天，各處理組試蟲的個體質(zhì)量與對照組間的差異也均達到顯著水平，且不同的處理組間也均有顯著差異，其中，石油醚提取物處理組試蟲的個體質(zhì)量最高，乙醚提取物處理組次之，乙酸乙酯提取物處理組試蟲的個體質(zhì)量最小。據(jù)此推斷，在菊苣葉片不同溶劑提取物中，石油醚提取物對粘蟲幼蟲個體質(zhì)量的抑制作用最小，乙醚提取物的抑制作用較大，而乙酸乙酯提取物的抑制作用最大。

表1 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲個體質(zhì)量的影響（±SD）1）Table1 Effect of d ifferen t solven t extracts from C icho rium in tybus L.leaf on ind iv idua l weigh t of larvae of Myth im na sepa ra ta Wa lker（± SD）1）

表1 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲個體質(zhì)量的影響（±SD）1）Table1 Effect of d ifferen t solven t extracts from C icho rium in tybus L.leaf on ind iv idua l weigh t of larvae of Myth im na sepa ra ta Wa lker（± SD）1）

1）同列中不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著 D ifferent small letters in the same column indicate the significant difference at0.05 level.

提取物Extract不同飼養(yǎng)時間幼蟲的個體質(zhì)量/m g Individualweight of larvae at different feeding times1 d 3 d 5 d 7d 9 d對照Contro l 20.95±0.54a 54.20±0.59a 79.90±2.52a 130.39±8.71a 192.73±11.19a乙酸乙酯提取物 Ethylacetate extract 15.91±0.68bc 17.57±0.49d 19.99±1.04d 32.25±1.41d 39.96±0.63d乙醚提取物 Ethyl ether extract 14.15±1.15c 23.95±2.57c 30.01±3.04c 55.30±7.54c 96.00±11.23c石油醚提取物 Petroleum ether extract 16.62±1.74b 31.17±2.19b 43.28±4.94b 86.34±12.55b 142.40±14.40b

2.2.2 對粘蟲幼蟲發(fā)育的影響 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲發(fā)育的影響見表2。菊苣葉片3種溶劑提取物對粘蟲發(fā)育的抑制程度有一定差異，在整個實驗期間石油醚提取物對試蟲的發(fā)育抑制率一直顯著低于乙酸乙酯和乙醚提取物。隨著飼養(yǎng)時間的延長，菊苣葉片不同溶劑提取物處理組粘蟲的發(fā)育抑制率變化略有差異。其中，乙酸乙酯提取物處理組粘蟲的發(fā)育抑制率持續(xù)升高，飼養(yǎng)第9天發(fā)育抑制率最高，為79.27％；乙醚和石油醚提取物處理組粘蟲的發(fā)育抑制率則表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，均在飼養(yǎng)第5天達到最大值，分別為62.44％和45.83％。

菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲發(fā)育的抑制效應(yīng)與其對幼蟲個體質(zhì)量的影響效應(yīng)基本一致，均為乙酸乙酯提取物的抑制作用最大，乙醚提取物也具有較大的抑制作用，石油醚提取物的抑制作用最小。

2.2.3 對粘蟲化蛹和存活狀況的影響 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲化蛹和存活狀況的影響見表3。由表3可見，與對照相比，經(jīng)不同溶劑提取物混合飼料飼養(yǎng)的粘蟲的幼蟲期均顯著延長，在乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物處理組中，試蟲的幼蟲期分別比對照延長了4.19、3.62和11.78 d。飼喂乙酸乙酯和乙醚提取物混合飼料的試蟲單蛹質(zhì)量均顯著大于對照，飼喂石油醚提取物混合飼料的試蟲的單蛹質(zhì)量與對照組間差異不顯著。

由表3還可見，飼喂菊苣葉片不同溶劑提取物混合飼料的試蟲的化蛹率和死亡率均受到一定程度的影響。總體上看，各處理組試蟲的化蛹率低于對照組、死亡率則高于對照組，且均與對照組間有顯著差異。其中，乙酸乙酯提取物的影響作用最大，飼喂乙酸乙酯提取物混合飼料的試蟲化蛹率僅為50.00％、死亡率高達57.80％。經(jīng)過計算，乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物處理組試蟲的校正死亡率依次為52.05％、26.40％和20.07％。

綜合分析結(jié)果顯示，在供試的3種菊苣葉片提取物中，乙酸乙酯提取物對粘蟲化蛹和存活狀況的影響效應(yīng)最大，石油醚提取物的影響效應(yīng)最小。

表2 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲發(fā)育的影響Table2 Effect of d ifferen t solven t extracts from C icho rium in tybus L.leaf on developm en t of Myth im na sepa ra ta Wa lker larvae

表3 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲化蛹及存活狀況的影響（±SD）1）Table3 Effects of d ifferen t solven t extracts from C icho rium in tybus L.leaf on sta tus of pupa tion and surv iva l of Myth im na sepa ra ta Wa lker larvae（±SD）1）

表3 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲化蛹及存活狀況的影響（±SD）1）Table3 Effects of d ifferen t solven t extracts from C icho rium in tybus L.leaf on sta tus of pupa tion and surv iva l of Myth im na sepa ra ta Wa lker larvae（±SD）1）

1）同列中不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著 D ifferent small letters in the same column indicate the significant difference at0.05 level.

提取物Extrac t幼蟲期/d Larval tim e單蛹質(zhì)量/mg Weightper pupa化蛹率/％ Pupation rate死亡率/％ Mo rtality校正死亡率/％ Co rrectedmortality對照Contro l 19.71±0.79c 285.15±9.24b 88.90±1.91a 12.00±3.46c -乙酸乙酯提取物Ethyl acetate extrac t 23.90±0.64b 345.89±25.05a 50.00±6.70c 57.80±8.40a 52.05乙醚提取物Ethyl ether extract 23.33±0.99b 335.99±19.80a 80.00±3.30b 35.23±1.37b 26.40石油醚提取物Petroleum ether extract 31.49±2.74a 313.95±20.57b 75.57±5.09b 29.66±4.51b 20.07

2.3 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲的拒食作用

實驗結(jié)果表明（表4），菊苣葉片3種溶劑提取物對粘蟲3齡幼蟲均有較強的拒食作用。3種溶劑提取物處理組的取食葉碟面積均小于對照組，其中，乙酸乙酯和乙醚提取物處理組在24、48和72 h的取食葉碟面積均顯著小于石油醚提取物處理組和對照組，而石油醚提取物處理組在24和48 h的取食葉蝶面積顯著小于對照組，但在72 h的取食葉碟面積與對照組差異不顯著。

從平均拒食率看，粘蟲3齡幼蟲對菊苣葉片乙酸乙酯和乙醚提取物的平均拒食率均在70％以上，均高于石油醚提取物。其中，乙酸乙酯提取物處理組的平均拒食率最高，24、48和72 h的平均拒食率分別達到84.56％、84.40％和84.43％；乙酸乙酯和乙醚提取物處理組的平均拒食率在72 h內(nèi)變化不大，而石油醚處理組的平均拒食率在72 h內(nèi)隨時間的延長明顯減小，至72 h時平均拒食率僅為16.67％。

表4 菊苣葉片不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲的拒食作用1）Table4 An ti-feed ing effect of d ifferen t solven t ex tracts from C icho rium in tybus L.leaf to Myth im na sepa ra ta Wa lker larvae1）

3 討論和結(jié)論

實驗結(jié)果顯示，菊苣葉片乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物的得率依次降低，以石油醚提取物的得率最低，僅1.08％。由于乙酸乙酯、乙醚和石油醚的極性依次遞減，根據(jù)相似相溶的原理，可初步推斷菊苣葉片中極性化學成分較多、親脂性成分相對較少。

隨著飼養(yǎng)時間的延長，菊苣葉片乙酸乙酯提取物處理組試蟲的發(fā)育抑制率呈持續(xù)升高的趨勢，而乙醚和石油醚提取物處理組則呈先升高后降低的趨勢，并在培養(yǎng)第5天達到最高值。這可能是由于實驗的前期至中期（1～5 d）都是用混合了不同提取物的混合飼料喂養(yǎng)試蟲，且正常狀態(tài)下第5天是粘蟲個體質(zhì)量增加幅度較大的時期，故發(fā)育抑制率最高；而實驗的中期至后期（5 d后）更換正常飼料喂養(yǎng)，乙醚和石油醚提取物對試蟲生長發(fā)育的抑制作用減小，表現(xiàn)為發(fā)育抑制率的減??；而乙酸乙酯提取物處理組雖然也更換了正常飼料喂養(yǎng)試蟲，但試蟲并沒有馬上恢復正常生長狀態(tài)，而是呈現(xiàn)平緩下降的過程，培養(yǎng)第7天至第9天，表現(xiàn)為乙酸乙酯提取物處理組試蟲的發(fā)育抑制率持續(xù)上升。說明菊苣葉片乙醚和石油醚提取物對粘蟲幼蟲發(fā)育的抑制作用小于乙酸乙酯提取物，且后者對粘蟲幼蟲發(fā)育的抑制作用有一定的持續(xù)性。菊苣葉片乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物處理組粘蟲的校正死亡率依次為52.05％、26.40％和20.07％；各處理組的幼蟲期均較對照組延長，且化蛹率也顯著小于對照組，并以乙酸乙酯提取物的影響最大；另外，乙酸乙酯和乙醚提取物處理組試蟲的單蛹質(zhì)量顯著大于對照組，可能與幼蟲期的延長（生長日數(shù)增加）有關(guān)。綜合分析結(jié)果表明，在菊苣葉片的3種溶劑提取物中，乙酸乙酯提取物對粘蟲生長發(fā)育的影響效果最顯著；石油醚為典型非極性溶劑，其提取物大部分為脂溶性成分，生物活性相對較低。

與菊苣同科的向日葵屬（HelianthusL.）植物內(nèi)含有豐富的倍半萜類化合物，且此類化合物具有抑菌等生物活性[26-27]，菊苣葉片中的活性成分是否屬于倍半萜類化合物，以及化合物結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系等問題，尚需進行進一步的成分分離和生物活性跟蹤測定。

不同溶劑提取物對粘蟲的生物活性與飼料中所含有毒成分的種類和性質(zhì)及粘蟲在不同發(fā)育時期的代謝能力有關(guān)[28]；食物中有害物質(zhì)的存在也可能會延長害蟲的生命周期[29]，導致害蟲生理周期的紊亂；通過添加植物的不同次生化學成分或改變飼料營養(yǎng)成分來誘導（或激發(fā)）昆蟲體內(nèi)的生理生化抑制機制以調(diào)節(jié)其生長發(fā)育過程[30]?？梢姡参锾崛∥飳οx的生物活性機制較復雜，因而，關(guān)于菊苣葉片提取物對粘蟲的致毒機制還需進一步深入研究和探討。

粘蟲取食經(jīng)菊苣葉片乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物處理的飼料后，其生長發(fā)育受到不同程度的影響，從而影響其個體質(zhì)量、單蛹質(zhì)量、化蛹率、死亡率及拒食率，并使其幼蟲期延長；菊苣葉片乙酸乙酯、乙醚和石油醚提取物雖然不能完全導致粘蟲死亡，但是能有效抑制粘蟲的生長發(fā)育，不同程度延長粘蟲的生長時期，錯開農(nóng)時進而減少粘蟲對作物的危害。使用菊苣葉片提取物合成的驅(qū)蟲劑，由于其成分來源于植物天然產(chǎn)物，因此無環(huán)境污染的潛在危險。由此可見，以菊苣為原材料開發(fā)生產(chǎn)農(nóng)用驅(qū)蟲劑非常符合“綠色環(huán)?！钡囊?，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中具有較廣闊的應(yīng)用前景。

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