全絲膠蠶品種絲膠蛋白酶的抗氧化能力

　　摘要：本文比較了全絲膠品種蠶繭熱水溶解的全天然絲膠蛋白質(zhì)與其他非全絲膠品種蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)及其絲膠蛋白酶的抗氧能力。結(jié)果表明，絲膠蛋白本身沒有抗氧化能力，不同品種的絲膠蛋白酶的抗氧化能力則各不相同，去除羥基自由基和去超氧自由基的能力，全天然黃綠絲＞全天然白絲＞菁松皓月＞遠(yuǎn)緣雜交黃絲＞遠(yuǎn)緣雜交白絲。
　　關(guān)鍵詞：全絲膠蠶品種　絲膠蛋白酶　抗氧化能力
　　
　　前言：
　　人類生存的環(huán)境中充斥著不計(jì)其數(shù)的自由基，我們無時(shí)無刻不暴露在自由基的包圍和攻擊中。炒菜油煙產(chǎn)生大量自由基，吸煙能最直接產(chǎn)生自由基。汽車尾氣、工業(yè)生產(chǎn)廢氣等環(huán)境污染產(chǎn)生的大量廢氣產(chǎn)生大量自由基。另外，人體自身新陳代謝過程中由于氧化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生自由基。
　　自由基對(duì)人體攻擊的途徑是多方面的，既有來自體內(nèi)的，也有來自外界的，自由基對(duì)人體的攻擊，既在最深層引起突變，又在最表層留下痕跡。自由基引發(fā)氧化作用，人體體外發(fā)生氧化，光和空氣容易產(chǎn)生活性氧化酶和促進(jìn)酪氨酸活性化活性，使皮膚發(fā)皺、產(chǎn)生斑點(diǎn)、變黑老化、引發(fā)皮膚癌變的可能。人體皮膚體內(nèi)發(fā)生氧化，由于活性氧化酶作用，會(huì)引起精神緊張、心累、苦痛、寒冷、感染等極其普遍的刺激，而產(chǎn)生生體機(jī)能的變化，與癌、動(dòng)脈硬化、糖尿病等具有密切關(guān)系。人類的食品發(fā)生氧化，人體本身是產(chǎn)生活性氧化酶和促進(jìn)酪氨酸活性化活性的好適環(huán)境，食品的氧化是酶的褐變和黑色素的積累過程，使食品變質(zhì)，營養(yǎng)破壞，導(dǎo)致一系列的食品制造、安全保鮮、營養(yǎng)吸收等惡劣后果。各種自由基所引發(fā)的氧化作用，是導(dǎo)致身體中各組織和器官損傷、病變的重要原因之一。人的衰老、動(dòng)脈硬化、心臟病、腫瘤、腎病、肝病、糖尿病、白內(nèi)障等近百種疾病的發(fā)生和發(fā)展均與自由基所引發(fā)氧化有關(guān)。
　　蛋白質(zhì)抗氧化能力的大小在于去除自由基的能力。因此，降低自由基危害極為重要。降低自由基危害的途徑也有兩條：一是利用內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)清除體內(nèi)多余自由基；二是發(fā)掘外源性抗氧化劑——自由基清除劑，阻斷自由基對(duì)人體的入侵。
　　不同分子量范圍的絲膠蛋白酶具有較強(qiáng)的自由基清除清除作用，非常適合于化妝品護(hù)膚品、醫(yī)藥保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用。然而，現(xiàn)行利用的絲膠基本上都是從生絲加工時(shí)排出的精煉液中回收的，或是從繭殼中用堿水和熱水溶出?；厥仗崛〉慕z膠蛋白容易變性，而且易混入分解物，透析、精制的工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。
　　日本在世界上首次育成了家蠶絲膠品種，絲膠含量達(dá)到98.5％。是直接用于各種絲膠高級(jí)化妝、保健等產(chǎn)品的優(yōu)良材料。本研究組利用日本引進(jìn)的絲膠品種資源和自主創(chuàng)新品種資源，采用遠(yuǎn)緣雜交、基因?qū)?、定向選育等方法，育成“綠s”和“白s”兩個(gè)絲膠特殊蠶品種，全天然絲膠蛋白含量達(dá)97％以上。本文在利用絲膠特殊蠶品種大量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的全天然純絲膠蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，探討絲膠品種生產(chǎn)的全天然絲膠蛋白質(zhì)及其絲膠蛋白酶的抗氧化能力。
　　
　　一、材料與方法
　　
　　1　材料
　　1.1　蠶繭品種
　　綠S　全天然黃綠色絲膠品種
　　白S　全天然白絲膠品種
　　YZ01　遠(yuǎn)緣雜交黃綠色普通品種
　　YZ02　遠(yuǎn)緣雜交白色普通品種
　　JS　菁松皓月現(xiàn)行普通品種
　　均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供。
　　
　　2　實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1　絲膠溶解
　　稱量供試品種蠶繭各5g，用溫水洗滌去掉贓物，剪成碎片，加入用氫氧化鈉調(diào)PH至10.5的溶液250ml，浸泡一小時(shí)，加入10g碳酸鈉/100ml，放入滅菌鍋在125℃煮2.5h，用紗布過濾，生絲用溫水洗滌三遍，合并蠶絲脫膠液和洗滌液，然后濾紙抽濾，獲得絲膠溶液。
　　2.2　絲膠溶液濃縮
　　絲膠溶液在80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約200ml，濃縮液加入400m195％的乙醇，搖勻，在6000r/min分離心10min，棄去上清，留下沉淀。
　　2.3　冷凍真空干燥
　　分別在試管中加入20ml絲膠濃縮液置于離心管中，往其中慢慢滴入0.1mol/l的鹽酸溶液，至溶液中有渾濁，放入在冷凍真空干燥儀在樣品溫度-33℃，壓強(qiáng)1帕斯卡條件下干燥。
　　
　　3　絲膠蛋白酶解物的抗氧化性
　　3.1　抗氧化性實(shí)驗(yàn)原理
　　清除羥基自由基：雙氧水在亞鐵離子的催化下會(huì)反應(yīng)生成羥基自由基，生成羥基自由基過程中，536nm和510nm處有光吸收的中間產(chǎn)物，當(dāng)加入超氧自由基清除劑時(shí)，能迅速與超氧自由基反應(yīng)，阻止中間產(chǎn)物的積累，致使溶液在320nm處吸收減弱，以水楊酸乙醇溶液作為捕捉劑，生成紫色，在波長510nm和536nm檢測吸光度來評(píng)價(jià)清除劑對(duì)羥基自由基的清除作用。
　　清除超氧自由基(-O2-)：采用鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生超氧自由基，鄰苯三酚在pH＞7.9后迅速自氧化。自氧化過程中形成一系列320nm處有光吸收的中間產(chǎn)物，當(dāng)加入超氧自由基清除劑時(shí)，能迅速與超氧自由基反應(yīng)，阻止中間產(chǎn)物的積累，致使溶液在320nm處吸收減弱。通過測定吸光度值加值來評(píng)價(jià)清除劑對(duì)超氧自由基的清除作用。
　　3.2　試劑的配制
　　0.05mol/l Tris-HCl緩沖液(pH8.2)：準(zhǔn)確稱量Tris：6.057g，加入990mL蒸餾水，混勻，使得Tris溶解，用1mol/1HCI調(diào)PH到8.2.
　　水楊酸乙醇溶液：準(zhǔn)確稱量水楊酸0.143g，用無水乙醇定容到100ml，搖勻。
　　3.3　去除羥基自由基的實(shí)驗(yàn)方法
　　用FeSO+HO產(chǎn)生-OH，以-OH氧化水楊酸鈉所得產(chǎn)物的吸光值表示OH的多少，吸光值越大，-OH越多。反應(yīng)試管中加入0.5ml，9mmol/1FeSO、0.5m19mmol/l水楊酸一乙醇及1ml不同濃度的樣品，最后加9mmol/1HO0.5m1啟動(dòng)反應(yīng)，37℃溫浴1h，取約0.1g絲膠蛋白溶于水作為樣品溶液，以0.5mL蒸餾水作空白代替待測液作空白試驗(yàn)，于536nm處測吸光值。
　　清除率(％)=[A3-(A1-A2)]/A3×1400
　　式中：A1為對(duì)照不加樣品；
　　A2為某濃度時(shí)的吸光值；
　　A3為無顯色劑時(shí)的該濃度的本底值。
　　3.4　清除超氧自由基的能力
　　取0.05mol/l Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)4ml，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入待測液0.5ml和25mmol/l鄰苯三酚溶液0.5ml，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8％的HCl0.2ml終止反應(yīng)，在320nm處測吸光度，取約0.1g絲膠蛋白溶于水作為樣品溶液，以0.5ml蒸餾水作空白代替待測液作空白試驗(yàn)，于536nm處測吸光值。
　　清除率(％)=[A3-(A1-A2)]/A3×100
　　式中：A1對(duì)照不加樣品；
　　A2底物濃度時(shí)的吸光值；
　　A3無顯色劑時(shí)的該濃度的本底值。
　　3.5　絲膠蛋白酶解物的抗氧化能力
　　絲膠蛋白酶解在試管中加入0.1g/ml風(fēng)味酶2ul、0.1g/l絲膠溶液、PH7.0、液溫50℃的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2h后，100℃水煮10min對(duì)酶的滅活后對(duì)其樣品溶液進(jìn)行吸光值測定，并計(jì)算去除自由基能力。
　　
　　二、結(jié)果與分析
　　
　　1　絲膠蛋白本身的去除羥基自由基能力
　　制備1g/1未經(jīng)過酶解的絲膠蛋白溶液，設(shè)置3個(gè)重復(fù)區(qū)，在波長536nm處進(jìn)行檢測吸光度，按照3.4的方法計(jì)算去除羥基自由基能力如表1。
　　
　　從表1可以看出，絲膠蛋白本身的去除羥基自由基的能力很差，幾乎沒有底物濃度的差別，最高的僅為2.469％，幾乎可以認(rèn)為絲膠蛋白本身沒有抗氧化能力。
　　
　　2　不同蠶繭提取的絲膠蛋白的去除羥基自由基的能力
　　取供試的5種絲膠蛋白，分別制備1g/1經(jīng)過風(fēng)味酶解的絲膠酶解物0.1g/1，設(shè)置0.02-0.10％的5個(gè)不同底物濃度，各3個(gè)重復(fù)區(qū)，在波長536nm處進(jìn)行檢測去除羥基自由基吸光度，按照3.4的方法計(jì)算去除羥基自由基能力，絲膠蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，去除羥基自由基的能力作為縱坐標(biāo)，得到圖1及圖2。
　　
　　圖1、圖2顯示同樣的趨勢，各種絲膠的去除超氧自由基的能力不同，基本上是全天然黃綠絲＞全天然白絲＞遠(yuǎn)緣雜交黃絲＞遠(yuǎn)緣雜交白絲＞菁松皓月，隨著蛋白濃度在增加，去除超氧自由基的能力也隨之增加，綠s的去除超氧自由基能力最高可達(dá)到25％以上，白S的去除超氧自由基能力也可達(dá)到20％以上。菁松皓月僅在7％左右。
　　
　　3　不同品種絲膠蛋白酶解物的去除超氧自由基的能力
　　取供試的5種絲膠蛋白，分別制備1g/1經(jīng)過風(fēng)味酶解的絲膠酶解物，設(shè)置0.02-0.10％的5個(gè)不同底物濃度，各3個(gè)重復(fù)區(qū)，在波長320nm處進(jìn)行檢測去除超氧自由基的吸光度，并且計(jì)算去除羥基自由基能力，絲膠蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，去除羥基自由基的能力作為縱坐標(biāo)，得到圖3。
　　
　　和圖1、圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，各種絲膠的去除超氧自由基的能力不同，基本上是全天然黃綠絲＞全天然白絲＞遠(yuǎn)緣雜交黃絲＞遠(yuǎn)緣雜交白絲＞菁松皓月，隨著蛋白濃度在增加，去除超氧自由基的能力也隨之增加，綠S的去除超氧自由基能力最高可達(dá)到40％以上，白S的去除超氧自由基能力也可達(dá)到25％以上。菁松皓月僅在7％左右。
　　
　　三、討論
　　
　　1　絲膠蛋白本身沒有抗氧化能力，但經(jīng)過酶解后的絲膠多肽具有較強(qiáng)的抗氧化性能力。
　　而“綠S”蛋白質(zhì)的酶解物消除自由基的能力遠(yuǎn)比其他品種絲膠強(qiáng)，其主要原因是“綠S”絲膠蛋白質(zhì)中的含有較多具有抗氧化、消除自由基的能力黃酮素。
　　2　隨著絲膠蛋白的增加。也就是底物濃度的增加，在酶的催化下水解，產(chǎn)生的具有去除超氧自由基的多肽的量就比較多，所表現(xiàn)的去除超氧自由基的能力就比較強(qiáng)，如果底物濃度再提高，相信去除自由基的效果會(huì)更明顯，但需要試驗(yàn)結(jié)果加以證實(shí)。
　　3　絲膠蛋白只有在酶解成多肽過程中才具有去除自由基的能力的結(jié)果，驗(yàn)證了山崎等絲膠蛋白本身幾乎不具有抗氧化作用的結(jié)論，驗(yàn)證了加藤的絲膠水解物具有較強(qiáng)抗氧化作用的結(jié)論，使兩位學(xué)者的觀點(diǎn)得到統(tǒng)一。
　　4　利用品種生產(chǎn)全天然純絲膠蛋白質(zhì)是研究和開發(fā)天然抗氧化劑在化妝品、保健食品、生物領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。
　　
　　編輯　田