基于微流控芯片的牡丹籽粕低聚茋類化合物抗癌活性的研究

寇麗莎，齊永紅，張 璇，申少斐，王德富，牛顏冰

(1.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801； 2.山西省果業(yè)工作站,太原 030001)

油用牡丹籽油含豐富的不飽和脂肪酸，有非常重要的保健及藥用價值。目前研究發(fā)現(xiàn)，油用牡丹籽提油后的副產物牡丹籽粕中含有多種茋類化合物，包括白藜蘆醇、suffruticosol A、suffruticosol B、suffruticosol C、trans-ε-viniferin、pauciflorol E、cis-ε-viniferin等[1]成分，具有抗真菌和細菌活性、抗氧化、抗腫瘤等作用。其中suffruticosol A對人胃癌細胞SGC-7901有抑制作用，suffruticosol C對Hepg2細胞生長活性有阻礙作用[2]。

細胞的增殖、分化、遷移都離不開信號分子在體內的擴散。控制和傳導這些信號分子，對研究生物學過程有十分重要的意義。生物體內，細胞所處環(huán)境是高度精確的，各種化學物質如生長因子、胞內蛋白信號等在時間和空間上不斷產生瞬時變化的濃度梯度。傳統(tǒng)的濃度梯度發(fā)生器有Zigmomd腔[2]、Boyden趨化小室[3]、Dunn腔[4]等。但這些發(fā)生器都是根據(jù)特定生物現(xiàn)象而設定，因此使用范圍有限，且產生的濃度梯度不穩(wěn)定[5]。

微流控芯片又稱芯片實驗室，是一項在微米尺度空間對流體進行操控的技術，以其高通量、高靈敏度、低消耗等優(yōu)點備受研究者關注[6]。近年來，濃度梯度微流控芯片技術逐漸興起，通過建立內部可控、穩(wěn)定的濃度梯度，將細胞培養(yǎng)、藥物篩選等其他技術有機結合起來，用于多種細胞生物學研究[7]。Somaweera 等[8]設計制作了具有256個細胞培養(yǎng)腔的濃度梯度微流控芯片，并對其功能進行模擬與試驗驗證；Kim等[9]利用濃度梯度微流控芯片與細菌相結合，對其進行藥敏試驗，篩選有效的抗生素及劑量；Kilinic等[10]設計制作可產生多種溶質的線性濃度梯度，研究A431表皮癌細胞表皮生長因子誘導的細胞凋亡。

目前鮮見有關以微流控芯片為平臺進行牡丹籽粕低聚茋類化合物抗癌活性的報道。本文以所設計的濃度梯度微流控芯片為基礎，研究油用牡丹籽粕低聚茋類化合物對人源性乳腺癌細胞(MCF-7)活性的抑制作用。另外，利用微流控芯片與細胞結合，能夠在體外模擬體內微環(huán)境，且該芯片可一次性產生多種濃度梯度，并能實現(xiàn)同時對細胞進行活性或凋亡的觀察。與傳統(tǒng)方法相比，節(jié)約樣品和試劑用量的同時也大大節(jié)省了研究時間；也為油用牡丹提油后副產物抗癌效果的研究利用提供一定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽，來自山西汾河牡丹實業(yè)股份有限公司提供的油用牡丹“鳳丹”種子。人源性乳腺癌細胞(MCF-7)，購自中國科學院上海細胞庫。

RTV615型聚二甲基硅氧烷(PDMS)、固化劑，購于美國Momentive Performance Materials公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，購于Biological Industries；雙抗和胰蛋白酶，購于全式金；吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)，購自凱基生物；PBS緩沖液，購自索萊寶；其他試劑均為分析純。試驗所涉及細胞培養(yǎng)相關的溶液均已進行無菌處理。

1.1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉碎機，IKA-數(shù)顯型旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA)，SHZ-DШ循環(huán)水式真空泵，KW-4A型臺式勻膠機(中國科學院微電子研究所)，D2F-6020真空干燥箱，DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，CP313電子天平，TH4-200 OLYMPUS倒置熒光顯微鏡(日本)，數(shù)字注射泵。

1.2 試驗方法

1.2.1 低聚茋類化合物的提取

參照劉普等[11]的方法加以修改進行油用牡丹籽粕低聚茋類化合物的提取。稱取適量牡丹籽粕粉，加入60%乙醇，利用閃式提取器進行提取。將提取液離心，取上清，70℃條件下減壓蒸發(fā)除乙醇，剩余物經真空冷凍干燥，稱重，用DMEM培養(yǎng)基(二甲基亞砜含量為0.5%)溶解，0.22 μm過濾，即為低聚茋類化合物提取液，4℃避光保存。

1.2.2 芯片的設計和制備

本試驗通過AutoCAD(AutoCAD 2017)設計并繪制微流控芯片，中間兩個進口，最外圈有8個細胞培養(yǎng)腔，其結構示意圖如圖1所示。繪制完成芯片，制備形成光掩膜。

圖1 芯片結構示意圖

掩膜制作完成后，將PDMS預聚體底物A膠(Base)和固化劑B膠(Curing agent)按一定質量比混合均勻注入膜中，抽真空排氣泡，放置烘箱，80℃烘烤約10 min固化，后將PDMS從原有模具上剝離，切割器切掉多余的PDMS部分，將切割好的芯片用打孔器進行打孔；同時，按照質量比12∶1再次稱取A膠和B膠，置于離心機內均勻混合；倒入載玻片，烘箱中放置3～5 min，烘烤完畢后，將原先切割、打孔后的芯片置于已烘干好的載玻片相應位置處，水平放置于烘箱中，加速雙層粘合，最后微流控芯片制作完畢。

1.2.3 濃度梯度的模擬

配制好的熒光素(100 μmol/L)和PBS在兩個入口處同時以一定流速通過注射泵注入芯片，倒置顯微鏡下對芯片管道進行觀察并拍照，用Image-Pro? Plus 6.0處理圖片，依次計算每個通道的平均熒光強度。

1.2.4 細胞培養(yǎng)與染色

依次用75%乙醇、無菌水沖洗芯片管道5次，紫外照射30 min，對芯片進行消毒處理[12]。人源性乳腺癌細胞(MCF-7)采用RPMI-1640培養(yǎng)基(血清10%)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至80%，用胰蛋白酶消化后制成細胞懸液。將制成的細胞懸液通入芯片內細胞培養(yǎng)腔，待細胞貼壁完全，加入已制備的牡丹低聚茋類化合物，48 h后對細胞進行染色。試驗采用AO/PI雙染的方法鑒定細胞活力[13-15]。在此過程中，正常細胞與AO結合，呈現(xiàn)綠色，膜通透性破壞的細胞被PI染成紅色。

2 結果與討論

2.1 微流控芯片

PDMS材料被廣泛用于微流控芯片制作過程中。由于PDMS透氣性好，因此細胞在PDMS芯片上生長時所需氧氣可完全通過PDMS的通透性獲得，且PDMS具有良好的透光性和生物相容性[11]，有利于培養(yǎng)過程中對細胞的實時觀察。

設計的芯片由多個蜿蜒管道形成不同濃度梯度。整個芯片結構由內向外分為溶液進口、梯度形成區(qū)和細胞培養(yǎng)區(qū)。芯片含兩輪輻射狀管道，用于液體的充分混合；芯片高度50 μm，包含兩個進口，在第一環(huán)管道處包含4個螺旋混勻管道，第二環(huán)管道處包含8個螺旋混勻管道。最外圈管道處連接著8個寬度700 μm、長度3 000 μm的細胞培養(yǎng)腔。圖2為制備的芯片實物圖。

圖2 芯片實物圖

2.2 芯片內濃度梯度的模擬

利用軟件CFD-ACE模擬芯片管道內濃度梯度分布圖，如圖3所示。

圖3 芯片內濃度梯度模擬

從圖3可以看出，模擬結果表明培養(yǎng)腔1的藥液濃度百分比為0%，培養(yǎng)腔2和8藥液濃度百分比為25%，培養(yǎng)腔3和7藥液濃度百分比為50%，培養(yǎng)腔5藥液濃度百分比為100%。另外，通過熒光試驗對軟件模擬結果進行相關驗證。試驗過程中，分別將熒光素和PBS以同樣流速從進樣口注入，不同濃度液流經分流、混合，最終形成5個濃度梯度。最后，對芯片內8個培養(yǎng)腔進行拍照，再利用Image-Pro? Plus 6.0分析芯片內熒光強度。結果表明，培養(yǎng)腔1～5內熒光強度呈比例逐漸增強。進一步對芯片管道的上中下3部分分析得，芯片內可形成穩(wěn)定熒光強度。

軟件CFD-ACE模擬結果和試驗結果數(shù)據(jù)對應，因此我們所設計的濃度梯度微流控芯片可用來產生精確的濃度梯度。

2.3 細胞培養(yǎng)與進樣

取100 μL細胞懸液(密度2×105mL-1)用于進樣。待細胞完全進入培養(yǎng)腔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。8～10 h即可完成細胞的貼壁，此時細胞呈不規(guī)則形。在持續(xù)灌流培養(yǎng)的條件下，細胞增殖。圖4為細胞培養(yǎng)24 h后芯片內細胞貼壁情況。

從圖4可以看出，細胞貼壁緊密、長勢良好，形態(tài)正常、無懸浮的細胞碎片。表明該芯片適合細胞的正常生長，適宜進行細胞相關研究，對試驗結果不會造成巨大誤差。

圖4 芯片中培養(yǎng)24 h后的MCF-7細胞

2.4 藥液對MCF-7細胞活性的作用

參照劉普等[11]的方法對油用牡丹籽粕進行低聚茋類化合物的提取，用含二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基配制藥液，質量濃度為1 mg/mL。采用圖2所示微流控芯片裝置，進口1加入藥液，進口2加入PBS，通過注射泵持續(xù)灌流培養(yǎng)。

正常的細胞中細胞膜是完整的，起著溝通細胞內外物質和信息交流的作用。當細胞活性下降時，細胞膜通透性改變。試驗采用AO/PI熒光雙染的方法檢測不同質量濃度梯度低聚茋類化合物作用細胞后細胞活性情況，鑒定細胞活力，結果見圖5、圖6。

從圖5可以看出，培養(yǎng)48 h后，低聚茋類化合物質量濃度為0 mg/mL的芯片培養(yǎng)腔內，細胞形態(tài)正常、大小均勻，有高于95%的活細胞，與AO結合呈現(xiàn)綠色；低聚茋類化合物質量濃度從0.25 mg/mL升高到1 mg/mL時，可觀察到細胞體積變小，細胞呈不規(guī)則形；質量濃度的不斷增加，使得芯片內正常細胞數(shù)目減少，細胞通透性增強，培養(yǎng)腔內與PI結合的細胞越來越多，即呈現(xiàn)紅色的個數(shù)越多。

圖6 不同質量濃度梯度低聚茋類化合物對MCF-7細胞活力的影響

從圖6可以看出，細胞染色后，通過Image-Pro? Plus 6.0對芯片管道內的細胞進行計數(shù)，可知不同質量濃度低聚茋類化合物作用MCF-7細胞48 h后，隨著低聚茋類化合物質量濃度的增加，細胞活力從97.56%下降到4.69%。

3 結 論

本試驗以設計的濃度梯度微流控芯片為研究平臺，探究牡丹籽粕低聚茋類化合物對MCF-7細胞的活性影響。藥液(低聚茋類化合物)和PBS分別從芯片進口1與進口2進入，在梯度產生單元中逐級分配、混合，進而生成多個質量濃度梯度。結果表明：細胞活性與藥液質量濃度梯度相關。隨著藥液質量濃度的增大，細胞活性下降，芯片細胞培養(yǎng)腔內細胞體積逐漸變小，細胞通透性增大。與傳統(tǒng)的研究濃度梯度與細胞活性的試驗相比較，采用微流控芯片裝置研究癌細胞活性的同時，可獲取大量數(shù)據(jù)，能明顯降低試驗試劑、細胞的消耗量，提高分析速度，加快研究進度。為研究牡丹籽粕低聚茋類化合物對腫瘤細胞的活性作用提供了大量的依據(jù)與理論基礎。