ISSR分子標(biāo)記內(nèi)生真菌接種大花紅景天的遺傳特征分析

崔晉龍,任曉琳,2,王夢亮*

(1.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,山西 太原 030006)

ISSR分子標(biāo)記內(nèi)生真菌接種大花紅景天的遺傳特征分析

崔晉龍1,任曉琳1,2,王夢亮1*

(1.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,山西 太原 030006)

為了探索活性內(nèi)生真菌ZPRa-R-1對宿主DNA遺傳性狀是否存在影響,采用ISSR分子標(biāo)記法對二者互作15 d的大花紅景天DNA多態(tài)性進(jìn)行分析研究。結(jié)果表明,采用12條ISSR引物對ZPRa-R-1接種的紅景天進(jìn)行擴增,可擴增出94條條帶,其中多態(tài)性條帶為82條,其百分比為87.23%。每條引物平均擴增7.83條帶,擴增片段長度在100～8 000 bp之間;菌苗互作15 d與對照組的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度分別為0.123 3～1.285 2和0.276 6～0.884 0;真菌接種的大花紅景天、無菌組培苗和真菌ZPRs-R-11之間的基因流Nm=0.138 8,小于1;聚類分析得到三個遺傳性狀分支,第Ⅰ大類包括對照組無菌大花紅景天及真菌與組培苗共培養(yǎng)1～10 d的樣品;第Ⅱ大類為真菌與組培苗共培養(yǎng)11～15 d的樣品;第Ⅲ大類為對照組ZPRa-R-1真菌;在接種的15 d內(nèi),共生時間越長,二者之間的遺傳相似系數(shù)越大,表明活性內(nèi)生真菌ZPRa-R-1能夠引起宿主紅景天遺傳性狀改變。

內(nèi)生真菌;ISSR;大花紅景天;遺傳性狀

內(nèi)生菌是一類生活史的全部或部分階段生長于植物組織內(nèi)部,而不引起植物明顯病狀的微生物[1]。近年來,人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌是重要的天然產(chǎn)物資源[2],也是影響植物發(fā)育、代謝的重要因素[3]。內(nèi)生菌與宿主植物之間存在著信號調(diào)控、基因交換等現(xiàn)象[4]。諸多研究表明,內(nèi)生真菌與宿主植物的共生,引起宿主植物生理功能和表型的變化,是真菌與宿主之間發(fā)生了DNA水平的相互作用[9],進(jìn)而導(dǎo)致宿主植物生理功能的變化,能夠?qū)λ拗髦参锏姆N子萌發(fā)、生長發(fā)育、生物與非生物脅迫、化合物積累等起重要作用[5],成為植物品質(zhì)改良與控制、病害防治、藥用植物道地性評價等不可忽視的重要因素[5]。

植物表型及生理功能取決于其基因序列的排列和組成,DNA分子水平的微小變化都可能導(dǎo)致植物生理和代謝功能的變化,不同的DNA分子序列組成表現(xiàn)出DNA分子片段的多態(tài)性,因此,對DNA分子水平多態(tài)性的檢測是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記是在SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)上建立起來的用于檢測DNA水平遺傳性狀的分析技術(shù)[6],引物一般為17～24 bp,具有穩(wěn)定性高、重復(fù)率好、試驗成本低、多態(tài)性好等優(yōu)點[7],廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、種群親緣關(guān)系、生物指紋圖譜、品種檢測等工作中[8]。

在前期研究工作中,課題組獲得了一株具有生物活性的紅景天內(nèi)生真菌ZPRa-R-1,與大花紅景天健康地共生,能夠誘導(dǎo)激活大花紅景天信號分子網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)致主要活性成分紅景天苷合成途徑中關(guān)鍵酶活性的增強,進(jìn)而促進(jìn)紅景天苷和酪醇等活性產(chǎn)物的積累[9]。為了進(jìn)一步檢測ZPRa-R-1接種宿主互作關(guān)系中DNA水平的變化,本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對ZPRa-R-1接種大花紅景天的一個試驗周期(15 d)中DNA分子多態(tài)性的變化進(jìn)行研究,旨在探索內(nèi)生真菌ZPRa-R-1對宿主DNA遺傳性狀的影響,為研究內(nèi)生真菌ZPRa-R-1的生物功能、大花紅景天藥材形成的生物影響因素及其品質(zhì)監(jiān)控等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

菌株ZPRa-R-1于2012年6月分離自我國長白山地區(qū)的長白紅景天(Rhodiolaangusta)根部,鑒定為瓶頭霉屬(Phialocephala)真菌[10],GenBank編號為No. KJ542299。保藏于山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所。

1.1.2 大花紅景天組培苗:本課題組于2012年9月采集于西藏的野生大花紅景天(R.crenulata)并建立的快繁組培苗[11],本實驗所用組培苗為第24世代轉(zhuǎn)接苗,穩(wěn)定生長一周后供接種用。

1.1.3 試劑：實驗中所用的EasyTaq PCR SuperMix,100 bp DNA Ladder等試劑由北京全式金生物技術(shù)公司提供。其它重要生化試劑由山西奧賽生物公司提供,ISSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ZPRa-R-1接種大花紅景天

將低溫儲藏的ZPRa-R-1菌株活化并接種于PDA培養(yǎng)基 [1 L配方:去皮土豆200 g,煮熟取汁,加葡萄糖20 g,瓊脂粉18 g,定容至1 L, pH自然。] 平板,在25℃條件下暗培養(yǎng),待菌落長至2/3平板直徑時,在菌落邊緣處均勻打取0.5 cm的菌餅,將3塊菌餅均勻放置于組培苗與MS培養(yǎng)基[11]接觸部位,光14 h/暗10 h交替;對應(yīng)溫度為28℃和22℃;濕度70%～75% RH;光照強度30 μmol/m2/s條件下培養(yǎng)。顯微檢測真菌侵入紅景天時開始計時,培養(yǎng)15 d,每天取樣1次,共15批次,記為15個樣;以接種以前獨立培養(yǎng)生長的ZPRa-R-1、大花紅景天組培苗分別作為對照;共計17個樣品,各設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 DNA的提取及檢測

植物總DNA的提取采用CTAB法[12],1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系

選取12條引物[13]進(jìn)行ISSR的PCR擴增標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系為EasyTaq PCR SuperMix 6 μL(2 mmol/L Mg2+),其它同上。PCR擴增程序為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min,退火1 min(退火溫度根據(jù)各個引物的最適退火溫度),72℃延伸1 min,40個循環(huán);72℃延伸7 min,4℃保存。

1.2.4 結(jié)果檢測及數(shù)據(jù)分析

采用1.5%凝膠電泳對ISSR擴增標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行檢測,電壓120 V,點樣5 μL,電泳完畢后,以8 000 bp DNA Maker為標(biāo)準(zhǔn),對每條引物的電泳條帶分別進(jìn)行統(tǒng)計,遷移率相同的條帶被認(rèn)為是同源性的,電泳圖譜上清晰且穩(wěn)定的條帶賦值為“1”,無條帶或弱帶的賦值為“0”,形成0/1矩陣。假設(shè)分析對象均符合Hardy-Weinberg平衡,用軟件PopGene 32[14]計算多態(tài)位點百分率(PPB)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)等。采用 NTSYS-pc2.10e[15]軟件對 Nei’s 遺傳距離進(jìn)行UPGMA(unweight pair-group method with arithmetic average)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZPRa-R-1與組培苗共生15 d的 ISSR多樣性分析

根據(jù)引物篩選結(jié)果篩選出擴增條帶清晰、重復(fù)性高的ISSR引物12條。12條ISSR引物共擴增出94條條帶,多態(tài)性條帶82條,多態(tài)性百分比為87.23%。每條引物平均擴增7.83條帶,擴增片段長度為100～8 000 bp,由此可看出菌苗互作后的擴增結(jié)果與對照組相比有新的條帶出現(xiàn)或原有條帶消失,部分引物的擴增結(jié)果見圖1。

ZPRa-R-1與組培大花紅景天互作15 d后的樣品及兩個對照組的Nei’s遺傳距離(D)和遺傳一致度(J),結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)顯示D為0.123 3-1.285 2,J為0.276 6-0.884 0。遺傳距離最近的是菌苗互作樣品與無菌培養(yǎng)的組培苗(D=0.123 3;J=0.884 0),遺傳距離最遠(yuǎn)的是真菌ZPRa-R-1與無菌組培苗(D=1.285 2;J=0.276 6)。

1-15 d refer to R. crenulata inoculated with ZPRa-R-1 in 1～15 days; 0 d is R. crenulata culture seedling which didn’t inoculate with fungus;J refer to endophytic fungi;M is MarkerFig.1 Amplification electrophorogram of ISSR primers I3(A) and I4(B)1～15 d依次為接種ZPRa-R-1為1～15 d的組培苗；0 d為未接菌組培苗；J為內(nèi)生真菌ZPRa-R-1；M為Marker圖1 ISSR引物I3(A)、I4(B)的擴增電泳示意圖

種群總基因多樣性(Ht)為0.365 3,種群內(nèi)基因多樣性(Hs)為0.079 4,種間分化系數(shù)(Gst)為0.782 7,真菌互作的大花紅景天、無菌組培苗和真菌ZPRs-R-11之間的基因流Nm=0.138 8,小于1,說明菌苗互作后真菌與宿主植物發(fā)生了一定程度的遺傳交換,但交換率較低。

2.2 ZPRa-R-1與組培苗共生15 d基于ISSR的聚類分析

17個樣品間的聚類結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.740 0時,17個樣品可以聚為三大類:第Ⅰ大類包括對照組無菌大花紅景天及ZPRa-R-1與組培苗的互作1～10 d后的紅景天組培苗;第Ⅱ大類包括ZPRa-R-1與組培苗的互作11～15 d后的紅景天組培苗;第Ⅲ大類只有對照組ZPRa-R-1真菌。這一結(jié)果表明,內(nèi)生真菌ZPRa-R-1接種大花紅景天,能夠引起植物DNA遺傳水平的變化。在所有樣品中,大花紅景天組培苗和內(nèi)生真菌 ZPRa-R-1之間具有最遠(yuǎn)的親緣關(guān)系;接種之后,在第1至第15天,接種苗與真菌ZPRa-R-1的親緣關(guān)系逐步變近;另外出現(xiàn)了接種前4天與無菌苗親緣關(guān)系近,第5至第10天相對獨立,第11天至第15天的接種苗與真菌ZPRa-R-1具有更近的親緣關(guān)系。這進(jìn)一步說明內(nèi)生真菌能導(dǎo)致共生植物的遺傳形狀發(fā)生變化。

表1 基于ISSR分析ZPRa-R-1與組培苗互作后的遺傳一致度(右上)和遺傳距離(左下)

Fig.2 Dendrograms of cluster for Rhodiola crenulata inoculated with ZPRa-R-1 based on ISSR molecular markers圖2 ZPRa-R-1與組培苗互作后ISSR聚類圖

3 討論

長期以來,人們評價藥用植物品質(zhì)的影響因素主要集中在植物的基因型和外環(huán)境因素如土壤、氣候、溫度、pH值等,忽略了植物內(nèi)環(huán)境中的生物因子[5]。自Strobel課題組從紅豆杉發(fā)現(xiàn)一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌以來,內(nèi)生真菌資源開發(fā)和內(nèi)生菌群落微生態(tài)功能逐步引起人們的重視,成為植物品質(zhì)研究中不可忽視的因素[16]。近來研究表明,植物的基因型、生理狀態(tài)、代謝組成等對其內(nèi)生真菌及群落具有選擇性,也能塑造不同于別的植株的特有內(nèi)生真菌微生態(tài)特征;同時,內(nèi)生真菌生長狀態(tài)也能對宿主的遺傳、代謝、應(yīng)對脅迫等方面造成影響,是植物特定生理狀態(tài)的反映[17]。因此,研究和開發(fā)植物內(nèi)生真菌,對于解決植物的生長發(fā)育、代謝物積累、生態(tài)演替等具有重要意義,是認(rèn)識和解決植物生長發(fā)育難題的新途徑。

植物遺傳多樣性的檢測包括了表型、細(xì)胞、染色體和DNA分子等技術(shù),而最為精確和活躍的領(lǐng)域當(dāng)屬DNA分子生態(tài)檢測[18],比如限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP),隨機擴增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)等[18]。而ISSR是一種最為新型的分子標(biāo)記手段之一，是以簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats,SSR)為基礎(chǔ),SSR存在于所有真核生物基因組中,均由1～4個堿基對組成,又稱之為微衛(wèi)星,如(GA)n、(AC)n、(GAA)n的DNA,同一類微衛(wèi)星DNA可分布在整個基因組不同位置上,由于其重復(fù)次數(shù)不同或重復(fù)程度不相同而形成每個座位的多態(tài)性。對它們的檢測實現(xiàn)對植物遺傳多樣性的檢測,具有靈敏、快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點[19]。

研究表明,采用ISSR技術(shù)能夠高效、準(zhǔn)確的檢測紅景天DNA的遺傳關(guān)系[13]。本課題組采用該技術(shù)對我國野生大花紅景天、庫葉紅景天、長白紅景天等遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究, 11條ISSR引物共擴增出102條條帶,多態(tài)性百分比達(dá)到100%,因此，是一種靈敏、高效、可靠的DNA分子檢測技術(shù)[20]。本研究采用ISSR技術(shù)首次開展內(nèi)生真菌ZPRa-R-1接種大花紅景天的DNA分子標(biāo)記分析,所選引物平均擴增出7.83條條帶,明確的觀察到DNA遺傳物質(zhì)在不同樣品中的變化,能很好地檢測和分析內(nèi)生真菌對宿主植物的影響。隨著ZPRa-R-1的侵入,大花紅景天遺傳性狀發(fā)生規(guī)律變化,即隨著試驗時間的延長,ZPRa-R-1接種的紅景天與內(nèi)生真菌之間的親緣關(guān)系逐步變近,而與非真菌影響的紅景天的遺傳關(guān)系則越來越遠(yuǎn);其中,第5天和11天分別發(fā)生了較大親緣關(guān)系的躍遷,這標(biāo)示著兩個物種互作過程中存在著遺傳物質(zhì)的互作關(guān)系;當(dāng)然,這對于內(nèi)生真菌與宿主之間DNA具體的互作和變化,還需要對特定基因進(jìn)行定位和檢測?？傊?本研究不僅為下一步的工作提供了基礎(chǔ)和方向,也深刻驗證了內(nèi)生真菌ZPRa-R-1作為生物因素可以對大花紅景天遺傳性狀造成影響,為內(nèi)生真菌ZPRa-R-1的應(yīng)用和大花紅景天品質(zhì)改良提供依據(jù)。

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ISSR Analysis ofRhodiolaCrenulataInoculated with Endophytic Fungus ZPRa-R-1

CUI Jinlong1,REN Xiaolin1,2,WANG Mengliang1*

(1.InstituteofAppliedChemistry,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2.Instituteofbiotechnology,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

The marker method of inter-simple sequence repeat (ISSR) was used to investigate genetic character ofRhodiolacrenulatainoculated with the endophytic fungus ZPRa-R-1 in 15 days. The results showed that a total of 94 bands were amplified by 12 ISSR primers. Among them, 82 bands were belonged to polymorphic bands, and the percentage of polymorphism band was 87.23% inR.crenulatainoculated with ZPRa-R-1. 7.83 bands were the average amplifying number with one primer. The lengths of amplified fragments were between 100～8 000 bp. Nei’s genetic distance and genetic consistency were 0.123～1.285 2 and 0.276 6～0.884 0, respectively. The gene flow was 0.138 8 amongR.crenulatainoculated with ZPRa-R-1,R.crenulataculture seelding and ZPRa-R-1, and the value was less than one which showed that genetic traits ofRhodiolaplant could be affected deeply by this endophytic fungus. The results of clustering analysis indicated thatR.crenulatainoculated with the fungus ZPRa-R-1 was dirided into three genetic branches. The first class includedR.crenulataculture seedling and its culture inoculated with ZPRa-R-1 in 1～10 days. The second class includedR.crenulataculture seedling inoculated with ZPRa-R-1 in 11～15 days. The third class is only included by ZPRa-R-1. The genetic similarity ofR.crenulatainoculated with ZPRa-R-1 would become more and more similar in 15 days test cycle. The results of this research showed that ZPRa-R-1 can affect the genetic traits ofR.crenulata.

endophytic fungi;inter-simple sequence repeat;Rhodiolacrenulata;genetic trait

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.01.025

2016-10-08；

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金(31270383;31670328)；山西省自然科學(xué)基金(2014011029-1)

崔晉龍(1976-)，男，博士，副教授，主要從事珍稀藥用植物活性成分調(diào)控藥用植物及藥用真菌資源開發(fā)研究，E-mail:CJL717@ 163.com；

*通信作者：王夢亮(WANG Mengliang),E-mail:mlwang@sxu.edu.cn

O75

A

0253-2395(2017)01-0155-05