基于1H NMR代謝組學技術探究GRP78蛋白對巨噬細胞極化的干預效應

張立超,李愛平,剌曉琴,李卓玉*

(1.山西大學 生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006;2.山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心重點實驗室,山西 太原 030006)

基于1H NMR代謝組學技術探究GRP78蛋白對巨噬細胞極化的干預效應

張立超1,李愛平2,剌曉琴1,李卓玉1*

(1.山西大學 生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006;2.山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心重點實驗室,山西 太原 030006)

巨噬細胞是腫瘤組織中一類十分重要的免疫細胞,它的M2型極化與腫瘤的惡化密切相關。GRP78蛋白作為腫瘤晚期的生物標志物,可以通過影響腫瘤微環(huán)境來促進腫瘤惡化,但GRP78對腫瘤組織中巨噬細胞的分化是否具有干預作用依然未知。本研究利用體外純化的GRP78蛋白來模擬腫瘤細胞分泌的GRP78,用其處理鼠源巨噬細胞RAW264.7,然后通過1H NMR技術的代謝組學方法發(fā)現(xiàn)經(jīng)GRP78處理后細胞中有18種代謝產(chǎn)物,培養(yǎng)基中有14種代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生了明顯變化。通過進一步的代謝通路分析,發(fā)現(xiàn)在GRP78蛋白處理后,RAW264.7細胞的糖酵解代謝明顯減弱,而脂肪酸和氨基酸代謝加強,這與M2型巨噬細胞的代謝類型一致,表明經(jīng)GRP78處理后,RAW264.7巨噬細胞向M2型分化。這一發(fā)現(xiàn)表明腫瘤微環(huán)境中GRP78的存在是腫瘤相關巨噬細胞以M2型為主的重要原因,這也為靶向GRP78的腫瘤治療提供了堅實的理論依據(jù)。

1H NMR;代謝組學;GRP78;巨噬細胞;分化

EngineeringofNationalMinistryofEducation,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2.ModernResearchCenterforTraditionalChineseMedicineandShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

實體腫瘤中巨噬細胞是一類很重要的免疫細胞,在腫瘤組織中其所占比重很大[1]。在腫瘤的發(fā)生階段,腫瘤浸潤的巨噬細胞以M1型為主,其主要通過糖酵解為自身提供能量,發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[2]。隨著腫瘤的發(fā)展,在晚期腫瘤組織中,M2型巨噬細胞占據(jù)主導地位,通過脂肪酸代謝為自身提供大量能量,從而便于分泌各種細胞因子幫助腫瘤細胞抵抗外界不良環(huán)境,并協(xié)助腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[3]。雖然針對M1和M2型巨噬細胞的功能研究已有較多報道[4-6],但是針對不同類型巨噬細胞在腫瘤不同發(fā)展階段的轉(zhuǎn)變機制一直是該領域的研究熱點。

分子量為78kD的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)屬于熱休克蛋白HSP70家族中的成員[7]，在正常細胞中其主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,發(fā)揮分子伴侶的作用[8]。在腫瘤細胞中,尤其是晚期腫瘤中,GRP78的表達量明顯升高,并且其定位和功能發(fā)生了多樣性變化[9]。有研究表明,晚期腫瘤細胞可以將GRP78分泌到細胞外,從而改變腫瘤微環(huán)境,有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[10-12]。晚期腫瘤細胞分泌的GRP78是否會影響腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的分化,又是通過怎樣的途徑產(chǎn)生影響的呢?這些都是亟待回答的問題。

代謝組學技術能夠快速鑒定生物體系的代謝物,評估生物體發(fā)生的微妙變化,并鑒定與生理病理變化相關的潛在生物標志物[13]。與LC-MS和GC-MS相比,氫核磁共振波譜法(1H NMR)因具有樣本制備簡單無損,檢測無偏向性,方法重現(xiàn)性好等優(yōu)點而被廣泛應用[14]。本研究基于1H NMR技術的代謝組學方法, 利用體外純化的GRP78蛋白來模擬腫瘤細胞分泌的GRP78,對其處理過的巨噬細胞及其相應的培養(yǎng)基中代謝物進行分析, 從代謝的角度闡明GRP78對巨噬細胞極化的干預效應。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker 600-MHz AVANCE III NMR Spectrometer(600.13 MHz質(zhì)子頻率,德國布魯克公司600兆核磁儀),TGL-16高速臺式冷凍離心機。

胎牛血清(FBS,浙江天杭生物科技有限公司,中國);DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA);分析純甲醇,雙蒸水;重水(Norell,Landisville,USA),三甲基硅烷丙酸鈉鹽(TSP,Cambridge Isotope Laboratories Inc.,MA)。

1.2 細胞培養(yǎng)

鼠源巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)于37℃,體積分數(shù)為5%CO2,恒溫恒濕的條件下。所用培養(yǎng)基為含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM。

1.3 GRP78蛋白表達與純化

GRP78蛋白表達與純化的具體步驟見文獻[12]。

1.4 核磁備樣

RAW264.7細胞培養(yǎng)于75 cm2培養(yǎng)瓶中,當細胞長至～70%時,在實驗組(n=3)細胞中加入終濃度為1 μmol·L-1的GRP78蛋白,對照組(n=3)細胞中加入相同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,分別收集細胞和培養(yǎng)液。培養(yǎng)液置于50 mL的尖底離心管中,300 g離心15 min,收集上層清液,并于液氮中速凍,-80℃保存。利用細胞刮收集細胞后,300 g離心5 min后,PBS洗滌細胞沉淀2次,離心后將沉淀于液氮中速凍,-80℃保存。

細胞和培養(yǎng)液的提取方法參照已報道方法[15]并加以改進,取2 mL培養(yǎng)液于5 mL EP中進行凍干;通過多次凍融和超聲波破碎裂解細胞,即凍融細胞5次后,加入800 μL甲醇水溶液(甲醇/水∶2/1,V/V),于冰上超聲破碎15 min(超聲3 s,停7 s),4℃ 13 000 g離心20 min,收集上層清液,并向沉淀中添加1 mL甲醇水溶液,重復以上步驟,收集兩次上清液于5 mL EP管中冷凍干燥。

向細胞和培養(yǎng)液提取物凍干粉中加入600 μL重水配制的PBS(pH 7.4),其中分別含有體積分數(shù)為0.005% 和0.02% TSP,4℃ 13 000 g離心20 min,取上清于5 mm NMR管中進行測試。

1.5 核磁測試條件

所有譜圖的測試在25℃于Bruker 600 MHz Avance Ⅲ NMR譜儀上完成。測試序列為Noesygppr1d,弛豫延遲3.0 s,譜寬12 626.3 Hz,掃描次數(shù)為64次。采用氘代重水鎖場,內(nèi)標為TSP。

1.6 數(shù)據(jù)處理

核磁圖譜采用MestReNova(version 10.0.1, Mestrelab Research,Santiago de Compostella,Spain)進行處理。所有核磁圖譜需手動定標,并進行相位和基線校準,以δ0.01積分段為基準對化學位移的區(qū)間進行分段積分。其中細胞圖譜中殘余水峰δ4.76～5.8和培養(yǎng)液中δ4.72～5.06不進行積分,將積分數(shù)據(jù)面積歸一化后導入excel中,以便于后續(xù)分析。

將上述數(shù)據(jù)矩陣導入SIMCA-P 13.0(Umetrics,Umea,Sweden)軟件中進行主成分分析(PCA),再用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)排列實驗(permutation)進行模型驗證,結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)S-plot和VIP (>1)尋找差異代謝物。對找到的差異代謝產(chǎn)物相對峰面積進行t檢驗,以期找出差異顯著的代謝物。最后,將差異代謝物數(shù)據(jù)導入代謝組學分析網(wǎng)站(http:∥www.Metaboanalyst.ca),采用Pathway Analysis功能模塊進行通路分析。

2 結(jié)果

2.1 核磁圖譜指認

通過核磁峰型、化學位移及化學耦合常數(shù)等核磁數(shù)據(jù)分析,結(jié)合標準品和文獻數(shù)據(jù)[15-16]對照,共指認了40種化合物,具體信息見表1。圖1為典型的細胞和培養(yǎng)基提取物的NMR指紋譜,鑒定的化合物包括氨基酸、有機酸、糖類等。直觀分析發(fā)現(xiàn),細胞處理前后,化學成分差異較大,而培養(yǎng)基中成分差異較小。

表1 細胞和培養(yǎng)基中代謝物指認表

續(xù)表1 細胞和培養(yǎng)基中代謝物指認表

Fig.1 Typical 1H NMR spectra of extracts of cell and medium.Cell (A), medium (B).圖1 典型的細胞和培養(yǎng)基提取物的NMR指紋譜。細胞(A);培養(yǎng)基(B)

2.2 多元統(tǒng)計分析

為闡明細胞和培養(yǎng)基處理前后的化學差異,進一步采用多元統(tǒng)計分析方法對其進行分析。PCA分析是目前常用的分析方法,它通過降低維度的技術把具有某些相關性的技術指標轉(zhuǎn)化為幾個具有綜合意義的指標的一種無監(jiān)督的模式識別方法,它能體現(xiàn)數(shù)據(jù)的最初狀態(tài)[17]。圖2A為RAW264.7細胞經(jīng)GRP78處理前后的PCA得分散點圖(PC1:0.885;PC2:0.04)顯示二者可以明顯區(qū)分。有監(jiān)督的PLS-DA排列實驗(permutation test)用于判別建立模型的有效性,在排列實驗中,回歸線的斜率越大,隨機化的R2、Q2差別越小,即原始模型的預測能力大于任何一次隨機排列y變量的預測能力,說明模型可靠,可以繼續(xù)后面差異成分的尋找,該分析結(jié)果(圖2B)顯示模型穩(wěn)定,預測率高(R2X=0.949,Q2=0.998)?？紤]到干擾因素的復雜性,為進一步消除非GRP78蛋白作用的影響,使組間分離最大化,并尋找兩組間差異明顯的代謝物,利用OPLS-DA(圖2C)方法去除與樣品的分類不相關的信息,對不同的樣本代謝全譜進行分析,CV-ANOVA分析顯示,p=0.0026<0.05進一步說明模型有效可靠,二者差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)合S-plot(圖2D)和VIP分析,結(jié)果見表2。

表2 GRP78處理后細胞中的差異代謝產(chǎn)物的變化趨勢(p<0.05)

Fig.2 PCA score plot (A), the PLS-DA permutation test (B), the corresponding OPLS-DA score plot (C)and S-plot (D) derived from the 1H NMR spectra from the GRP78 treated cells and the control圖2 細胞處理前后的PCA散點圖(A),排列實驗(B),OPLS-DA散點圖(C),S-plot(D)

以相同的方法處理培養(yǎng)基數(shù)據(jù)矩陣,由PC1(0.748)和PC2(0.166)為坐標軸構(gòu)建的PCA得分散點圖(圖3A)可以看出,培養(yǎng)基對照組與處理組樣本能夠明顯分開,說明GRP78處理對培養(yǎng)基的代謝物有影響。PLS-DA(圖3B)模型驗證顯示模型有效可靠。圖3C為對照組和處理組培養(yǎng)基的OPLS-DA得分圖(R2=0.998,Q2=0.992,p=0.0116<0.05),二者同樣具有明顯差異。對應的S-plot圖(圖3D)和VIP值進行分析,結(jié)果見表3。

表3 GRP78處理后培養(yǎng)基中的差異代謝產(chǎn)物(p<0.05)

Fig.3 PCA score plot (A), the PLS-DA permutation test (B), the corresponding OPLS-DA score plot (C)and S-plot (D) derived from the 1H NMR spectra from the GRP78 treated medium and the control圖3 培養(yǎng)基處理前后的PCA散點圖(A),排列實驗(B),OPLS-DA散點圖(C),S-plot(D)

2.3 代謝通路分析

為探討以上差異代謝物涉及的代謝途徑,采用專業(yè)的代謝組學數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站metaboAnalyst 3.0功能模塊Pathway Analysis對其進行數(shù)據(jù)庫比對分析,歸納這些代謝物所在的生物網(wǎng)絡,并可以自動篩選出影響最大的代謝通徑。將細胞中找到的18個具有顯著差異的代謝物導入相關模塊,結(jié)果如圖4A所示,橫坐標Pathway impact 表示由拓撲分析所得到的代謝通徑對本研究的重要性值,縱坐標-log(P)表示代謝通路的富集分析。圖中圓點越大,顏色越深,表明該通徑影響越大,即該圓點離中心的距離越遠。本研究將代謝通徑影響值設置為 0.10,當代謝通路影響值高于這個值,即被視為潛在的靶標代謝路徑。結(jié)果顯示細胞處理后代謝物的變化主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝,牛磺酸和亞?；撬岽x,丙酮酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,糖酵解和糖異生,脂類代謝等。以相同的方法分析與細胞處理前后培養(yǎng)基中差異代謝物密切相關的代謝途徑,如圖4B所示,這些代謝物主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝,?；撬岷蛠喤；撬岽x,二羧酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等?？偨Y(jié)以上這些通路分別與葡萄糖代謝、脂肪酸代謝以及氨基酸代謝緊密相關。

1.Valine, leucine and isoleucine biosynthesis, 2.Taurine and hypotaurine metabolism, 3.Pyruvate metabolism,4.Glycine, serine and threonine metabolism, 5.Glycolysis or Gluconeogenesis, 6.Glycerophospholipid metabolism.1’. Valine, leucine and isoleucine biosynthesis, 2’.Glyoxylate and dicarboxylate metabolism, 3’.Alanine, aspartate and glutamate metabolism.Fig.4 Summary diagram of pathway analysis with MetPA Cell(A),medium(B)1.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成;2.?；撬岷蛠喤；撬岽x;3.丙酮酸代謝;4.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;5.糖酵解和糖異生;6.脂類代謝;1’.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成;2’.二羧酸代謝;3’.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝圖4 GRP78處理后細胞和培養(yǎng)基中差異代謝物涉及的代謝通路分析 細胞(A)，培養(yǎng)基(B)

3 討論

巨噬細胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,擁有很高的“可塑性”,并且不同類型巨噬細胞所擁有的代謝途徑完全與其功能相匹配[18]。在機體受到微生物感染和發(fā)生炎癥的情況下,巨噬細胞的M1表型首先被激活,為了適應感染部位的缺氧環(huán)境,M1型巨噬細胞主要通過糖酵解代謝為自身提供能量。當病原體被徹底清除后,巨噬細胞又活化為M2型,其異?；钴S的脂肪酸代謝為完成受損組織的修復和血管的再生提供了充足的能量[19]。所以通過代謝組學技術檢測經(jīng)GRP78蛋白處理后巨噬細胞的主要代謝途徑,可以比較全面的揭示巨噬細胞的分化類型。

葡萄糖是機體的主要能量來源,通過多步反應,葡萄糖分解為丙酮酸；如果處在缺氧條件下,則丙酮酸經(jīng)由糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為乳酸,這一過程是M1型巨噬細胞獲取能量的主要途徑[20]。本研究發(fā)現(xiàn)處理組糖酵解代謝的主要產(chǎn)物——乳酸的含量顯著降低,表明經(jīng)GRP78處理后RAW264.7細胞中糖酵解代謝減弱。這一現(xiàn)象說明經(jīng)GRP78蛋白處理后,RAW264.7細胞的代謝類型與M1型巨噬細胞相反。另外,在處理組的培養(yǎng)基中有較多的乳酸存在,從另一方面表明經(jīng)GRP78處理后的RAW264.7細胞對乳酸的偏好性較差,所以將其大量排出細胞。

M2型巨噬細胞在幫助受損組織修復和血管生成的過程中需要消耗大量能量,而脂肪酸的氧化恰好可以滿足細胞的這一需求[21]。本研究中經(jīng)GRP78處理的RAW264.7細胞中發(fā)現(xiàn)有大量的脂肪酸代謝中間產(chǎn)物(lipid-CH2),提示這些細胞中脂肪酸代謝旺盛。另外,GRP78處理后細胞和培養(yǎng)基中的支鏈氨基酸大量減少(如纈氨酸、異亮氨酸),這些氨基酸可能通過轉(zhuǎn)氨作用脫掉α-氨基,進入三羧酸循環(huán)。甘氨酸能夠轉(zhuǎn)化為胍基乙酸,后者可與甲硫氨酸反應生成肌酸。據(jù)報道甘氨酸和肌酸是重要的儲能物質(zhì)[22]。本研究中甘氨酸和甲硫氨酸含量降低說明GRP78處理后細胞中儲能物質(zhì)被消耗，這些現(xiàn)象表明GRP78處理后的巨噬細胞正在進行大量的耗能過程,而這些現(xiàn)象恰好與M2型巨噬細胞的代謝表型相吻合。

4 結(jié)論

本研究通過核磁代謝組學技術,發(fā)現(xiàn)模擬腫瘤細胞分泌型的GRP78蛋白可以減緩巨噬細胞的糖酵解代謝,促進巨噬細胞中脂肪酸和支鏈氨基酸的代謝,表明經(jīng)GRP78處理后巨噬細胞在進行大量的耗能過程。這一系列現(xiàn)象都提示GRP78可以誘導巨噬細胞RAW264.7向M2型分化,而M2型巨噬細胞是腫瘤惡化的重要推動者，這表明GRP78的存在是腫瘤組織中巨噬細胞向M2型分化的重要原因。

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Investigation of the Intervention of GRP78 on Macrophage using1H NMR-based Metabolomics

ZHANG Lichao1,LI Aiping2,LA Xiaoqin1,LI Zhuoyu1*

(1.InstituteofBiotechnology,KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecular

Macrophage is one of important immunocytes in tumor, and the M2 macrophage is closely related with tumor progression. GRP78, as a biomarker of advanced tumor, can switch tumor microenvironment to facilitate tumor progression, however, whether GRP78 can affect the macrophage polarization is still unknown.The recombinant GRP78 that mimics the tumor cell secreted-GRP78 was applied to incubate with RAW 264.7 cell, then we found 18 metabolites in cell and 14 metabolites in medium,which were different with the control using1H NMR-based metabolomics. Through further analysis of metabolic pathway, we found the glycolysis decreased significantly in RAW264.7 with GRP78 treatment while fatty acid and amino acid metabolism increased, which was in accordance with the metabolic type of M2 macrophage, implying that the RAW264.7 polarized into M2 type after GRP78 treatment. This study suggested that the tumor cell-secreted GRP78 may be primarily responsible for the M2 polarization of tumor-associated macrophages, and it also provides a solid theoretical basis for GRP78-targeted oncotherapy.

1H NMR;metabolomics;GRP78;macrophage;polarization

山西大學學報(自然科學版)40(1)：169-174，2017JournalofShanxiUniversity(Nat．Sci．Ed．)

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.01.026

2016-10-06；

2016-11-25

山西省平臺項目(2015091015)；山西省留學基金(2015-7)

張立超(1988-)，男，山西大同人，博士研究生，研究方向：腫瘤分子生物學。

*通信作者：李卓玉(LI Zhuoyu),E-mail:lzy@sxu.edu.cn

Q7

A

0253-2395(2017)01-0160-09