自體與新鮮同種異體骨軟骨移植的實驗研究

應(yīng)小樟 石仕元 胡德新 鄭 琦 魏 威 杭州市紅十字會醫(yī)院骨科 杭州310003

關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管、神經(jīng)和淋巴管的組織，缺乏基質(zhì)干細(xì)胞，其自我修復(fù)能力極其有限。近幾年國內(nèi)已先后開展自體骨軟骨鑲嵌移植，并有良好的臨床報道［1，2］。但該方法的軟骨供區(qū)十分缺乏，制約了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如何克服這種供區(qū)不足的困難，依然是關(guān)節(jié)外科醫(yī)生的挑戰(zhàn)。本實驗采用含富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨鑲嵌移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，并與自體骨軟骨移植進(jìn)行比較研究。通過大體、光鏡觀察及Wakitani組織學(xué)評分，探討新鮮同種異體骨軟骨移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用健康成年純種新西蘭大白兔16只，雌雄不限，體質(zhì)量3.0～4.5 kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22℃。實驗動物分為兩組(自體軟骨移植、含富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨移植)，每組8只16膝。兩組動物均不限制運動。手術(shù)前觀察所有動物無跛行，雙膝關(guān)節(jié)活動正常。

1.2 方法

1.2.1 制備軟骨缺損模型 將兔用3%戊巴比妥鈉，以1m l/kg體重兔耳緣靜脈注射麻醉。兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)縱行切口，保持髕韌帶完整性，將髕骨翻向外側(cè)，顯露股骨髁，在股骨髁中部髕股關(guān)節(jié)處用利刀制造相應(yīng)大小的全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，深達(dá)軟骨下骨質(zhì)，平均深度約5.0mm。

1.2.2 自體骨軟骨移植 自體移植組用特制取骨器在股骨外髁非負(fù)重區(qū)取相應(yīng)大小骨軟骨柱，直徑約4.0mm，長度約5.0mm，分別鑲嵌移植于缺損鉆孔處，與所鉆孔徑及深度相匹配，保證牢固嵌合，并著重注意保持移植后關(guān)節(jié)面平整，無明顯凹凸?？p合關(guān)節(jié)囊及滑膜，關(guān)閉切口。

1.2.3 同種異體骨軟骨移植 異體移植組隨機(jī)將該組動物骨軟骨柱對換移植，具體手術(shù)方法同自體移植組。

1.2.4 術(shù)后處理 兩組動物術(shù)后均肌注青霉素16萬單位，1天1次，共用藥1周，預(yù)防感染。未用免疫抑制劑，飲食條件相同。不限制運動，于術(shù)后第2周開始自由活動，于開闊環(huán)境中飼養(yǎng)，人為促進(jìn)運動每天半小時。

1.2.5 觀察方法 各組動物于術(shù)后12周處死，取股骨髁關(guān)節(jié)面骨軟骨移植處為標(biāo)本。①大體觀察:實驗動物跛行程度和恢復(fù)情況，關(guān)節(jié)活動度(固定髖關(guān)節(jié)，距膝關(guān)節(jié)遠(yuǎn)側(cè)相等距離懸掛同等重量砝碼，測量膝關(guān)節(jié)活動度)，關(guān)節(jié)內(nèi)有無粘連，修復(fù)組織表面的平整光滑程度、有無凹陷，顏色、質(zhì)地、移植物充填程度、與周圍健康軟骨組織連接情況，軟骨退變情況，髕骨溝輪廓恢復(fù)情況。②組織學(xué)光鏡檢查:用0.1%的甲醛溶液固定缺損修復(fù)區(qū)及部分周邊正常軟骨，將標(biāo)本以甲酸乙醇液脫鈣1周，分別做蘇木精—伊紅染色和Masson染色切片，觀察優(yōu)勢新生組織的性質(zhì)、表面特性、與正常軟骨連接等組織學(xué)特性等。組織學(xué)評分:將標(biāo)本蠟塊包埋、切片，行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色，按照Wakitani法評分標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)結(jié)果評分表進(jìn)行評分。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理，采用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 活體觀察 術(shù)后1周，全部動物活動減少，跋行，雙膝略腫脹;1周后漸輕，稍有跋行。以后11周中采用改良的Clakeweeknesser檢查標(biāo)準(zhǔn)(固定髓關(guān)節(jié)，距膝關(guān)節(jié)遠(yuǎn)側(cè)相等距離懸掛同等重量砝碼，測量膝關(guān)節(jié)活動度)測量動物關(guān)節(jié)伸屈活動范圍，可見術(shù)后12周，自體骨軟骨移植組膝關(guān)節(jié)活動度均優(yōu)于同種異體移植骨軟骨組(P＜0.01)，見表1。

2.2 標(biāo)本大體觀察 ①自體骨軟骨移植組:關(guān)節(jié)腔無粘連，無積液，關(guān)節(jié)液淡黃色，關(guān)節(jié)內(nèi)無退變增生。關(guān)節(jié)面顏色呈乳白色，和周圍軟骨面無明顯差異，表面光滑平整，與周圍正常軟骨融合良好。②異體骨軟骨移植組:關(guān)節(jié)囊有少許攣縮，質(zhì)硬，關(guān)節(jié)內(nèi)纖維束帶與關(guān)節(jié)表面充填組織有少許粘連，移植骨軟骨柱與受區(qū)融合，界限模糊。移植的軟骨面萎縮變薄，少數(shù)有軟骨面破損，關(guān)節(jié)面不平，色灰暗，標(biāo)本軟骨面整個被包裹在纖維組織與炎性組織中，股骨的髕骨關(guān)節(jié)溝輪廓不清，退變增生嚴(yán)重。

表1 兩組膝關(guān)節(jié)伸屈活動范圍比較±s)度

表1 兩組膝關(guān)節(jié)伸屈活動范圍比較±s)度

組 別 n/只 術(shù)后4周 術(shù)后8周 術(shù)后12周8 45.15±2.15 57.51±3.92 68.35±3.75異體骨軟骨移植組 8 44.76±2.48 48.21±2.51 52.97±3.53 P自體骨軟骨移植組＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 組織學(xué)光鏡觀察 ①自體移植組:骨組織與受區(qū)骨性愈合，關(guān)節(jié)軟骨的厚度與受區(qū)正常軟骨基本一致，軟骨為透明軟骨特性，透明軟骨細(xì)胞排列規(guī)律，可見軟骨陷窩，潮線清楚，表面平整無退變。②同種異體骨軟骨移植組:移植物軟骨下板層、骨髓松質(zhì)骨與宿主基本連接愈合，但松質(zhì)骨小梁周圍尚未完全骨化。新生的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞幼稚占多數(shù)。交界處淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和多核白細(xì)胞浸潤減少。無移植的其他缺損區(qū)無軟骨形成。

2.4 組織學(xué)評分 按照Wakitani法評分標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)結(jié)果評分表進(jìn)行評分，設(shè)5項觀察指標(biāo):細(xì)胞形態(tài)學(xué)、基質(zhì)染色(異染性)、表面規(guī)則性、軟骨厚度、與周圍軟骨整合度。其中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)評分為:透明軟骨0、透明軟骨為主1、纖維軟骨為主2、少量軟骨3、無軟骨4;基質(zhì)染色(異染性)評分為:正常0，輕度減少1，明顯減少2，無異染性顏色3;表面規(guī)則性評分為:光滑0，中等1，不規(guī)則2，極度不規(guī)則3;軟骨厚度評分為:＞2/3為0，1/3～2/3為1，＜1/3為2;周圍軟骨整合度評分為:邊緣完全整合為0，一側(cè)邊緣整合為1，未整合為2。

術(shù)后12周，按照Wakitani法評分標(biāo)準(zhǔn)自體骨軟骨移植較新鮮異體骨軟骨移植在細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)染色、表面平整、軟骨厚度、周圍接合及總分方面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后自身修復(fù)能力十分有限，較大面積的缺損無法自行修復(fù)。臨床上應(yīng)用的方法主要有:①微骨折技術(shù):通過穿透軟骨下骨板，使包含骨髓多能間充質(zhì)干細(xì)胞的血凝塊聚集在軟骨缺損區(qū)的表面，形成含有Ⅱ型膠原的纖維軟骨覆蓋缺損區(qū)。該技術(shù)操作簡單易行、成本低下，常被用作首選的治療方案。綜合各方面的文獻(xiàn)資料［3～5］，該方法適用于軟骨缺損面積小于1cm2的患者。②骨軟骨的嵌鑲移植術(shù):自體骨軟骨移植的方法是通過關(guān)節(jié)邊緣非負(fù)重區(qū)作為供區(qū)，選擇軟骨厚度適宜的部位，獲取一定數(shù)量、大小及長度的骨軟骨柱作為移植物，待處理好受區(qū)后予以植入，不需固定。該方法完好地保持了關(guān)節(jié)軟骨和骨床的緊密連接，具有取材方便，植入穩(wěn)定，愈合成活率高及關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)能力強等優(yōu)點，而且可以在關(guān)節(jié)鏡下完成手術(shù)。近幾年在國內(nèi)已先后開展該手術(shù)，臨床報道效果良好。而同種異體骨軟骨嵌鑲移植的效果卻報道不一，未在臨床上開展。

表2 兩組移植面組織學(xué)評分比較(±s)

表2 兩組移植面組織學(xué)評分比較(±s)

只 細(xì)胞形態(tài) 基質(zhì)染色 表面平整 軟骨厚度 周圍接合 總分自體骨軟骨移植組 16 0.13±0.34 0.38±0.50 0.25±0.45 0.25±0.45 0組 別 n/.38±0.50 1.38±1.71異體骨軟骨移植組 16 2.88±0.62 2.13±0.34 2.25±0.45 1.88±0.34 1.88±0.34 11.00±4.04 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

目前的實驗研究主要集中在兩個方面:①組織移植:主要有自體或異體的骨軟骨、軟骨、骨膜等。②細(xì)胞移植:主要有自體或異體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨的腦胎軟骨細(xì)胞、軟骨膜細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及與載體一起在體外培養(yǎng)構(gòu)建的工程軟骨等。

組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的研究近幾年不斷增加，研究主要集中在軟骨組織工程載體、種子細(xì)胞和生物調(diào)控因子等方面。載體材料包括天然和人工合成可降解的復(fù)合物。天然材料主要有膠原、明膠、纖維蛋白和藻酸鹽等，存在的問題主要是力學(xué)性能差，極易為活性酶降解，吸收過快。人工合成高分子聚合物具有良好的生物相容性，常用的有聚酸乳、聚羥基乙酸及其共聚物。種子細(xì)胞目前常用的有軟骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和胚胎干細(xì)胞(ESs)。生物調(diào)控因子繁多，其中以骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的研究最多，現(xiàn)在采用基因重組技術(shù)已成功分離和克隆出近40種BMP，在體外誘導(dǎo)軟骨表型分化方面發(fā)揮了顯著的作用。國內(nèi)學(xué)者以藻酸鹽、聚乳酸、骨基質(zhì)明膠為載體，采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞修復(fù)兔軟骨損傷方面已取得一定的成果［6～8］?？傮w分析，該類方法操作復(fù)雜，用于臨床尚早。

本實驗探討同種異體骨軟骨用于修復(fù)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的可行性。通過采用多種觀察指標(biāo)比較了自體和同種異體骨軟骨移植兩種方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。實驗結(jié)果顯示，新鮮無處理的同種異體骨軟骨鑲嵌移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損不行，其排斥反應(yīng)及吸收破壞嚴(yán)重，療效不確切，不建議使用。

［1］ 董啟榕，鄭祖.自體嵌鑲式骨軟骨移植修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2003，19:461-462.

［2］ 張維春，高石軍，陳百成等.關(guān)節(jié)鏡下自體骨軟骨移植修復(fù)股骨關(guān)節(jié)面軟骨缺損［J］.中華骨科雜志，2004，24:158-161.

［3］ Frisbie DD，Oxford JT，Southwood L，et al.Early events in cartilage repair after subchondral bonemicrofracture［J］.Clin Orthop Relat Red，2003，407:215-227.

［4］ Sledge SL.Microfracture techniques in the treatment of osteochondral injuries［J］.Clin sports Med，2001，20:365-377.

［5］ Gobbi A，Nunag P，Malinowski K.Treatment of full thickness chondral lesion of the knee with microfracture in a group of athletes［J］.Knee Surg Sports Traumator Arthrosc，2005，13:213-221.

［6］ 石仕元.關(guān)節(jié)鏡下自體骨軟骨移植修復(fù)股骨髁軟骨缺損［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2007，23:863-864.

［7］ 陸寧，盧世壁，王維芳，等.采用自體成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的軟骨組織工程修復(fù)［J］.中華實驗外科雜志，2005，22:293-297.

［8］ 尹戰(zhàn)海，韓健，劉淼，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合骨基質(zhì)明膠構(gòu)建組織工程化軟骨［J］.中華骨科雜志，2005，25:170-175.