好氧反硝化芽孢桿菌篩選及其反硝化特性

安 健,宋增福,楊先樂(lè),黃志華,張小能

上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù),上海 201306

好氧反硝化芽孢桿菌篩選及其反硝化特性

安 健,宋增福,楊先樂(lè)＊,黃志華,張小能

上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù),上海 201306

從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中篩選出多株具有好氧反硝化性能的芽孢桿菌,其中芽孢桿菌 YX-6能夠在 14 h內(nèi)將ρ(亞硝酸鹽氮)由 10 mg/L降至 0;ρ(DO)為 5.2～5.8 mg/L時(shí),該菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率接近 100%.試驗(yàn)選取具有降氮功能的芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌,比較研究了芽孢桿菌 YX-6在不同 pH,溫度,ρ(亞硝酸鹽氮)和鹽度時(shí)的好氧反硝化性能.結(jié)果表明,芽孢桿菌 YX-6的好氧反硝化性能顯著高于陽(yáng)性對(duì)照菌 (P＜0.05).通過(guò)對(duì)芽孢桿菌 YX-6的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化及 16S rDNA分子鑒定,初步鑒定其為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans).

好氧反硝化;芽孢桿菌;亞硝酸鹽

自 20世紀(jì) 80年代 ROBERTSON等[1]首次分離出好氧反硝化細(xì)菌〔Thiosphaera pantotropha,現(xiàn)更名為脫氮副球菌 (Paracoccus denitrificans)〕以來(lái),好氧反硝化細(xì)菌的分離及其反硝化性能的研究與應(yīng)用得到了迅速發(fā)展,目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)屬的細(xì)菌具有好氧反硝化功能,如 Microvirgula aerodenitrificans[2-5],副球菌屬 (Paracoccus sp.)[6],假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)[7-10]和產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes sp.)[11-12]等.好氧反硝化細(xì)菌最重要的特點(diǎn)是能夠在有氧環(huán)境中發(fā)揮反硝化作用,將 NO-或NO-還原為N2[1].好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)與研究,拓寬了人們對(duì)微生物反硝化現(xiàn)象的認(rèn)識(shí),為有氧條件下氮素的去除開(kāi)辟了新的途徑.

水產(chǎn)養(yǎng)殖中,過(guò)量的亞硝酸鹽氮對(duì)水生動(dòng)物具有相當(dāng)?shù)亩竞ψ饔?并有可能進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)菌病、病毒病等病害,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失.每年類似的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮,在夏季高溫季節(jié),這種情況更為突出[13-14].因此,養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的有效去除是水產(chǎn)業(yè)亟待解決的問(wèn)題之一.

在目前高密度集約化養(yǎng)殖模式下,氧氣的充足供給是保證健康水產(chǎn)養(yǎng)殖的必要條件;而傳統(tǒng)反硝化細(xì)菌多為厭氧菌,有氧條件下其對(duì)亞硝酸鹽氮的降解性能必定受到一定的抑制,這毫無(wú)疑問(wèn)地將造成現(xiàn)有生產(chǎn)模式與傳統(tǒng)降解亞硝酸鹽氮方法之間的矛盾,好氧反硝化細(xì)菌恰恰為解決該矛盾提供了思路和出路.

芽孢桿菌作為益生功能菌已得到廣泛應(yīng)用,目前雖有一些關(guān)于芽孢桿菌降解亞硝酸鹽氮作用的報(bào)道[15-16],但大都停留在試驗(yàn)研究階段;同時(shí),由于養(yǎng)殖水體環(huán)境的復(fù)雜多變與菌種降氮穩(wěn)定性不足等因素的影響,即使有所應(yīng)用,效果也并不理想.因此,筆者從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),篩選能適應(yīng)復(fù)雜養(yǎng)殖水體環(huán)境、降解亞硝酸鹽氮性能穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)芽孢桿菌,進(jìn)而有效地解決養(yǎng)殖水體有氧條件下亞硝酸鹽氮的積累問(wèn)題,以期為水產(chǎn)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

試驗(yàn)所用樣品采集于高密度對(duì)蝦養(yǎng)殖池水與池塘底泥.

1.1.2 對(duì)照菌種

陽(yáng)性對(duì)照菌選用有降氮功能的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BYK00318-01-01和蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)BYK00045-01-01(由國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)提供).

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L,牛肉膏 5 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.0.

LB固體培養(yǎng)基：在 LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂15～20 g/L.

LB高鹽培養(yǎng)基：在 LB液體培養(yǎng)基中將 NaCl的量增至 30 g/L.

BTB培養(yǎng)基[17]：天冬酰胺酸 1 g/L,KNO31 g/L,KH2PO41 g/L,FeCl2·6H2O 0.05 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,BTB 1 g/L,瓊脂 20 g/L,pH 7.0～7.2.

反硝化培養(yǎng)基 (測(cè)定性能)：琥珀酸鈉 4.72 g/L,NaNO20.05 g/L,KH2PO41.5 g/L,Na2HPO40.42 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,pH 7.2.

所有培養(yǎng)基經(jīng) 0.11 MPa,121℃,滅菌 20 min.

1.2 方法

1.2.1 好氧反硝化芽孢桿菌的篩選

1.2.1.1 耐鹽芽孢桿菌的篩選

將采集的水樣與泥樣先在 LB液體培養(yǎng)基(NaCl 5 g/L)中培養(yǎng) 18～24 h后,于 75～80℃水浴鍋中處理 10～15 min,再將培養(yǎng)物在 LB高鹽培養(yǎng)基 (NaCl 30 g/L)固體平板中進(jìn)行稀釋涂布,選取生長(zhǎng)良好的單個(gè)、不規(guī)則、表面粗糙的菌落反復(fù)劃線分離進(jìn)行純培養(yǎng).

1.2.1.2 好氧反硝化芽孢桿菌的初篩及復(fù)篩

將篩選出的耐鹽芽孢桿菌稀釋涂布在 BTB顯色平板上,30℃下培養(yǎng) 1～2 d,挑選出能夠使 BTB平板變成藍(lán)色的菌種為目的初篩菌.將初篩菌種活化后按 1%(體積比)的量接入 100 mL反硝化培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng) 24 h,測(cè)定溶液中的ρ(亞硝酸鹽氮),選擇亞硝酸鹽氮去除量較多的菌株為復(fù)篩菌.

1.2.2 好氧條件下芽孢桿菌的反硝化性能

1.2.2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)與好氧反硝化性能的測(cè)定

試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng) 18 h后按 1%(體積比)的添加量接種到 200 mL的反硝化培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng),每隔 2 h取樣 1次,每次取樣 10 mL,先測(cè)定細(xì)菌光密度 A600,然后經(jīng)8 000 r/min離心,取上清液測(cè)定培養(yǎng)液中的ρ(亞硝酸鹽氮).

1.2.2.2 溶解氧與菌體反硝化性能的測(cè)定

試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng) 18 h后,按 1%(體積比)的添加量接種到 100 mL反硝化培養(yǎng)基中,通過(guò)搖床控制轉(zhuǎn)速分別為 0,100,150,200,250和 300 r/min,培養(yǎng) 24 h后測(cè)定培養(yǎng)液中的ρ(亞硝酸鹽氮)和ρ(DO).

1.2.2.3 不同 pH下細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮的降解

試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng) 18 h后按 1%(體積比)的添加量接種到 pH分別為 3,5,7,9和 11的 100 mL反硝化培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h后,測(cè)定ρ(亞硝酸鹽氮);同時(shí),以枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌,比較研究試驗(yàn)菌株在不同 pH下的反硝化性能.

1.2.2.4 不同溫度下細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮的降解

試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng) 18 h后按 1%(體積比)的添加量接種到 100 mL反硝化培養(yǎng)基中,分別在 10,15,20,25,30,35和 40℃下經(jīng) 200 r/min搖床振蕩培養(yǎng) 24 h后,測(cè)定ρ(亞硝酸鹽氮);同時(shí),以枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌,比較研究試驗(yàn)菌株在不同溫度條件下的反硝化性能.

1.2.2.5 不同ρ(亞硝酸鹽氮)對(duì)細(xì)菌好氧反硝化性能的影響

試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng) 18 h后,按 1%(體積比)的添加量分別接種到初始ρ(亞硝酸鹽氮)為 20,40,60,80和 100 mg/L的 100 mL亞硝酸鹽氮反硝化培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng) 24 h后,測(cè)定ρ(亞硝酸鹽氮);同時(shí),以枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌,比較研究試驗(yàn)菌株在不同ρ(亞硝酸鹽氮)下的反硝化性能.

1.2.2.6 不同鹽度下細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮的降解

配制鹽度分別為 5,10,15,20,25和 30的人工海水并添加反硝化培養(yǎng)基,將純培養(yǎng) 18 h后的菌株按 1%(體積比)的添加量分別接種到 100 mL反硝化培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng) 24 h后,測(cè)定ρ(亞硝酸鹽氮);同時(shí),以枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌,比較研究試驗(yàn)菌株在不同鹽度下的反硝化性能.

1.2.3 分析方法

ρ(亞硝酸鹽氮)的測(cè)定采用 N-1-萘 -乙二胺比色法[18];A600的測(cè)定采用紫外分光光度法;ρ(DO)的測(cè)定采用碘量法 (GB7489—87).

1.2.4 試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)方差 (n=3)表示,運(yùn)用 SPSS.11.0軟件,經(jīng) One-Way ANOVA分析,采用Duncan’s多重檢驗(yàn)分析試驗(yàn)結(jié)果平均值的差異顯著性,設(shè)差異水平α=0.05(P＜0.05為差異顯著).

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧反硝化芽孢桿菌篩選

對(duì)采集水樣與泥樣進(jìn)行菌種分離,初步篩選出18株細(xì)菌,通過(guò)形態(tài)及染色觀察后發(fā)現(xiàn)這 18株細(xì)菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌,產(chǎn)芽孢.將這些細(xì)菌通過(guò)BTB培養(yǎng)基初篩,從中篩選出 8株能夠使 BTB平板變色的細(xì)菌,對(duì)這 8株細(xì)菌的好氧反硝化性能進(jìn)行比較研究,最終篩選出一株能夠高效降解亞硝酸鹽氮的菌株,該菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率可達(dá) 100%,經(jīng)生理生化及 16S rDNA分子鑒定,該菌與凝結(jié)芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近,同源性達(dá) 98%,初步鑒定其為凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)(數(shù)據(jù)另有文章報(bào)道),試驗(yàn)中以芽孢桿菌 YX-6命名.

2.2 好氧條件下芽孢桿菌的反硝化性能

2.2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)與好氧反硝化性能的測(cè)定

如圖 1所示,隨著細(xì)菌的生長(zhǎng),4 h后芽孢桿菌YX-6得以迅速增殖,該階段為細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;同時(shí),芽孢桿菌 YX-6能夠在 14 h內(nèi)將初始量為 10 mg/L的亞硝酸鹽氮降解為 0,去除率達(dá) 100%.2.2.2 ρ(DO)對(duì)細(xì)菌反硝化性能的影響

圖 1 芽孢桿菌YX-6生長(zhǎng)與亞硝酸鹽氮的降解曲線Fig.1 Dynamicsof Bacillus YX-6 growth and degradation curvesof nitrite nitrogen

如圖 2所示,隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大,反硝化培養(yǎng)基中的ρ(DO)不斷增高.芽孢桿菌 YX-6對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率也隨著ρ(DO)的增高而增大,但當(dāng)ρ(DO)超過(guò) 5.8 mg/L時(shí),該菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率逐漸降低.

圖 2 ρ(DO)對(duì)芽孢桿菌 YX-6降解亞硝酸鹽氮的影響Fig.2 Effectsof DO mass concentration on the nitrite nitrogen degradation of Bacillus YX-6

2.2.3 pH對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的影響

如圖 3所示,3種菌的反硝化活性均能在 pH為7時(shí)達(dá)到最大,而芽孢桿菌 YX-6能夠在 pH為 5～9的范圍內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率保持近 100%.pH為 3時(shí),芽孢桿菌 YX-6對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率可達(dá) 80%,pH為 11時(shí)其仍具有一定的反硝化活性;而 2株陽(yáng)性對(duì)照菌在 pH為 3和 9～11的范圍內(nèi)的反硝化活性則相對(duì)較低.

2.2.4 溫度對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的影響

如圖 4所示,隨著溫度的升高,3株菌的反硝化活性不斷增加,當(dāng)溫度為 30℃時(shí),3株菌的反硝化活性均達(dá)到最大,對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率接近100%.隨著溫度的繼續(xù)升高,3株菌的去除率有明顯下降的趨勢(shì),相比 2株陽(yáng)性對(duì)照菌,芽孢桿菌YX-6能夠在 25～40℃的范圍內(nèi)始終保持較高的反硝化活性,在 40℃的高溫下其對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率仍可達(dá) 90%以上.

圖 3 p H對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的影響Fig.3 Effectsof pH on the nitrite nitrogen degradation of strains

圖 4 溫度對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的影響Fig.4 Effectsof temperature on the nitrite nitrogen degradation of strains

2.2.5 ρ(亞硝酸鹽氮)對(duì)細(xì)菌反硝化性能的影響

如圖 5所示,當(dāng)ρ(亞硝酸鹽氮)為 20 mg/L時(shí),芽孢桿菌 YX-6和枯草芽孢桿菌均可保持較高的反硝化活性,其對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率接近 100%.隨著初始ρ(亞硝酸鹽氮)的增高,3株菌的反硝化性能逐漸降低.當(dāng)ρ(亞硝酸鹽氮)為 100 mg/L時(shí),芽孢桿菌 YX-6對(duì)亞硝酸鹽氮仍有近 20%的去除率.

圖 5 ρ(亞硝酸鹽氮)對(duì)細(xì)菌反硝化性能的影響Fig.5 Effectsof nitritemass concentration on the nitrite nitrogen degradation of strains

2.2.6 鹽度對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的影響

如圖 6所示,當(dāng)鹽度為 5～15時(shí),3株菌始終保持較高的反硝化活性,隨著鹽度繼續(xù)增高,3株菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率逐漸降低,其中芽孢桿菌YX-6和蠟樣芽孢桿菌的去除率相對(duì)較高.在鹽度為 30的高鹽度水環(huán)境中,蠟樣芽孢桿菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率幾乎為 0,而芽孢桿菌 YX-6仍有近30%的去除率.

圖 6 鹽度對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的影響Fig.6 Effectsof salinity on the nitrite nitrogen degradation of strains

3 討論

好氧反硝化細(xì)菌在自然界中廣泛存在,現(xiàn)已有多種分離方法能夠有效地篩選出好氧反硝化細(xì)菌[19-20].目前已分離出較多種類的好氧反硝化細(xì)菌,但多數(shù)菌種為陰性菌[1-12],帶有潛在的致病性;同時(shí),部分菌種對(duì)水體中溶解氧的耐受性較差,反硝化效率偏低[21-23].因而,當(dāng)前所分離出的菌種不適合高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的亞硝酸鹽的降解應(yīng)用,篩選適合水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用的好氧反硝化細(xì)菌優(yōu)良菌種及其快速篩選方法的研究已顯得尤為必要.筆者在該試驗(yàn)條件下,通過(guò)對(duì)好氧反硝化芽孢桿菌的篩選,先分離出有一定耐鹽特性的益生芽孢桿菌,再對(duì)具有好氧反硝化性能的芽孢桿菌進(jìn)行初篩及復(fù)篩,最終篩選出一株高性能的好氧反硝化芽孢桿菌 YX-6,該菌能夠在 14 h內(nèi)將 10 mg/L的亞硝酸鹽氮降解為 0,去除率達(dá) 100%.

ρ(DO)對(duì)細(xì)菌的反硝化性能至關(guān)重要.PATUREAU等[2,24]認(rèn)為,反硝化還原酶系和有氧呼吸系統(tǒng)同時(shí)存在于好氧反硝化細(xì)菌中,缺少 NO->x或O2都會(huì)降低細(xì)菌的生長(zhǎng)率和反硝化效率.HUANG等[25]研究指出,溶解氧是細(xì)菌進(jìn)行好氧反硝化的關(guān)鍵因素,當(dāng)ρ(DO)為 2～6 mg/L時(shí),最適于細(xì)菌生長(zhǎng)及反硝化性能的發(fā)揮.該研究表明,隨著ρ(DO)的增加,芽孢桿菌 YX-6的反硝化性能不斷提高,在ρ(DO)為 5.2～5.8 mg/L時(shí)該菌的反硝化活性最高,其對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率接近 100%,可見(jiàn)該菌的反硝化活性與ρ(DO)密切相關(guān);但當(dāng)ρ(DO)超過(guò) 5.8 mg/L時(shí),該菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率明顯下降.這與于愛(ài)茸等[16]的研究結(jié)果相左,同時(shí)也很難用閾值理論來(lái)解釋,可見(jiàn)不同菌種的好氧反硝化機(jī)制存在較大差異,需作進(jìn)一步研究.

研究表明,反硝化作用主要發(fā)生在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,該階段隨著菌體的快速增殖,水體中硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的量迅速下降[26],這與馬放等[27]的研究結(jié)果相符.pH對(duì)細(xì)菌反硝化作用的發(fā)揮有較大影響,pH過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制反硝化還原酶的活性.GUPTA等[28-29]的研究表明,細(xì)菌反硝化還原酶的最適 pH是中性或微堿性,當(dāng)環(huán)境 pH偏離該最適范圍時(shí),細(xì)菌的反硝化活性會(huì)相應(yīng)降低.該研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌 YX-6對(duì)環(huán)境 pH的變化顯示出了較強(qiáng)的適應(yīng)能力,其能夠在 pH為 3～11的范圍內(nèi)保持較高的反硝化活性;在 pH為 5～9的范圍內(nèi),該菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率保持接近 100%,顯著高于陽(yáng)性對(duì)照菌.這遠(yuǎn)比文獻(xiàn)[16,30]中報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌 pH適應(yīng)范圍要廣,可能是由于該菌株的反硝化還原酶對(duì) pH耐受性較強(qiáng)等原因所致.

溫度是影響反硝化還原酶活性的一個(gè)重要因素,反硝化作用最適溫度范圍為 25～35℃,溫度過(guò)高或過(guò)低,均會(huì)抑制反硝化還原酶的活性[31].該研究表明,芽孢桿菌 YX-6的反硝化最適溫度也在該溫度范圍內(nèi).在 25～40℃范圍內(nèi)芽孢桿菌 YX-6對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率可達(dá) 90%以上,而陽(yáng)性對(duì)照菌在 40℃高溫下的反硝化活性幾乎喪失.這可能與芽孢桿菌 YX-6的反硝化還原酶耐熱機(jī)能有關(guān),需進(jìn)一步對(duì)其反硝化還原酶基因的耐熱特性進(jìn)行研究.由此表明,芽孢桿菌 YX-6的反硝化還原酶熱穩(wěn)定性更好,更適合用于高水溫環(huán)境的降氮應(yīng)用.

養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽的過(guò)度積累,不僅會(huì)對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用,而且一定濃度的亞硝酸鹽還會(huì)抑制菌體的反硝化活性,而有關(guān)亞硝酸鹽對(duì)細(xì)菌反硝化活性影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.該研究表明,芽孢桿菌 YX-6在高濃度的亞硝酸鹽環(huán)境下仍可保持較高的去除率,其對(duì)亞硝酸鹽毒性的耐受性顯著強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照菌,當(dāng)ρ(亞硝酸鹽氮)超過(guò) 20 mg/L時(shí)會(huì)對(duì)菌體反硝化還原酶活性產(chǎn)生抑制作用,可見(jiàn) 20 mg/L的ρ(亞硝酸鹽氮)是抑制細(xì)菌反硝化活性的一個(gè)臨界值.這與于愛(ài)茸等[16]的研究結(jié)果相近,可見(jiàn)亞硝酸鹽對(duì)菌體反硝化還原酶的基因表達(dá)具有一定的影響.

自然界嗜鹽細(xì)菌主要包括古細(xì)菌中的Haloarcula,Halobacterium,Haloferax及細(xì)菌中的Halomonas和 Bacillus等屬的某些種[32].YOSH IE等[33]研究指出,鹽度對(duì)菌體反硝化還原酶活性有一定的抑制作用.有關(guān)芽孢桿菌反硝化活性與鹽度的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道.該研究表明,在鹽度為 0～30的范圍內(nèi),芽孢桿菌 YX-6對(duì)亞硝酸鹽氮均可保持較高的去除率;鹽度為 30時(shí),其對(duì)亞硝酸鹽氮仍然可保持近 30%的去除率.這可能與芽孢桿菌的耐鹽機(jī)制及菌種的分離環(huán)境有關(guān),該特性使得芽孢桿菌 YX-6在海水養(yǎng)殖降氮及淡水養(yǎng)殖降氮等方面的應(yīng)用存有較大優(yōu)勢(shì).

目前有關(guān)芽孢桿菌屬的菌種,如蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniform),均有文獻(xiàn)報(bào)道[15,34]其具有好氧反硝化性能.該研究篩選出的芽孢桿菌 YX-6經(jīng)生理生化及 16S rDNA測(cè)序分析,初步鑒定其為凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans).筆者對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的好氧反硝化性能及其與養(yǎng)殖水體環(huán)境因子的相互影響作了較為充分的研究,但有關(guān)該菌的好氧反硝化特性及反應(yīng)機(jī)制仍需作進(jìn)一步研究.

[1] ROBERTSON L A,KUENEN J G.Aerobic denitrification：a controversy revived[J].A rchivesof Microbiology,1984,139(4)：351-354.

[2] PATUREAU D,BERNET N.Effect of dissolved oxygen and carborr nitrogen loadson denitrification by an aerobic consortium[J].Appl Microbiol Biotechnol,2000,54(4)：535-542.

[3] PATUREAU D,GODON J J,DABERt P,et al.Microvirgula aerodenitrificans gen.sp.nov.,a new Gram-negative bacterium exhibiting co-respiration of oxygen and nitrogen oxides up to oxygen-saturated conditions[J].Int J Syst Bacteriol,1998,48(3)：775-782.

[4] PATUREAU D,HELLOIN E,RUSTRIAN E,et al.Combined phosphate and nitrogen removal in a sequencing batch reactor using the aerobic denitrifier,Microvirgula aerodenitrificans[J].Water Res,2001,35(1)：189-197.

[5] PATUREAU D,ZUMSTEIN E,DELGENES J P,et al.Aerobic denitrifiers isolated from diverse natural and managed systems[J].Microbiol Ecol,2000,39(2)：145-152.

[6] TAKAYA N,CATALAN-SAKA IRIMA,SAKAGUCHIY,et al.Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(6)：3152-3157.

[7] KA JO,URBANCE J,YE R W,et al.Diversity of oxygen and Noxide regulation of nitrite reductases in denitrifying bacteria[J].FEMSMicrobiology Letters,1997,156(1)：55-60.

[8] CHEN F,XIA Q,JU L K.Aerobic denitrification of Pseudomonas aeruginosa monitored by online NAD(P)H fluorescence[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(11)：6715-6722.

[9] VOLLACK K U,HARTIG E,KORNER H,et al.Multip le transcriptionfactors of the FNR family in denitrifying Pseudomomas stutzeri：characterization of four fnr-like genes,regulatory responses and cognate metabolic processes[J].Mol Miccrobiol,1999,31(6)：1681-1694.

[10] SU J J,L IU B Y,L IN J,et al.Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain NS-2 from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in Taiwan possessing denitrification under 92%oxygen atmosphere[J].Appl Microbiol,2001,91(5)：853-860.

[11] OTANIY,HASEGAWA K,HANAKI K.Comparison of aerobic denitrifying activity among three cultural species with various carbon sources[J].Water Sci Technol,2004,50(8)：15-22.

[12] OZEKI S,BABA I,TAKAYA N,et al.A novel C1-using denitrifier Alcaligenes sp.STC1 and its genes for coppercontaining nitrite reductase and azurin[J].Biosci Biotechnol Biochem,2001,65(5)：1206-1210.

[13] 曲克明,徐勇,馬紹賽,等.不同溶解氧條件下亞硝酸鹽和非離子氨對(duì)大菱鲆的急性毒性效應(yīng)[J].海洋水產(chǎn)研究,2007,28(4)：83-88.

[14] 王鴻泰,胡德高.池塘中亞硝酸鹽對(duì)草魚(yú)種的毒害及防治[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào) ,1989,13(3)：207-214.

[15] 楊希,劉德立,鄧靈福,等.蠟狀芽孢桿菌好氧反硝化特性研究[J].環(huán)境科學(xué)研究,2008,21(3)：155-159.

[16] 于愛(ài)茸,李尤,俞吉安.一株耐氧反硝化細(xì)菌的篩選及脫氮特性研究[J].微生物學(xué)雜志,2005,25(3)：77-81.

[17] NAOKI T,MARIA A B C S,YASUSHI S,et al.Applied denitrifying bacteria that produce low level of nitrous oxide[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(6)：3152-3157.

[18] 雷衍之.養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2006：60-62.

[19] 孔慶鑫,李君文,王新為,等.一種新的好氧反硝化菌篩選方法的建立及新菌株的發(fā)現(xiàn)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2005,11(2)：222-225.

[20] 汪蘋,項(xiàng)慕飛,翟茜.從不同反應(yīng)器篩選、鑒別好氧反硝化菌[J].環(huán)境科學(xué)研究,2007,20(4)：120-124.

[21] LUKOW T,DIEKMANN H.Aerobic denitrification by newly isolated heterotrophic bacterium strain TLl[J].Biotechnology Letters,1997,11(19)：1157-1159.

[22] PA I S I,CHONG N M,CHEN C H.Potential application of aerobic denitrifying bacteria asbioagents in wastewater treatment[J].Bioresource Technology,1999,68(2)：179-185.

[23] KESSER P,KISS I,BIHARIZ,et al.Biological denitrification in a continuous-flow p ilot bioreactor containing immobilized Pseudomonas butannovora cells[J].Bioresource Technology,2003,87(1)：75-80.

[24] JOO H S,HIRA IM,SHODA M.Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis No.4[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2005,100(2)：184-191.

[25] HUANG H K,TSENG S K.Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment[J].Appl Environ Microbiol,2001,55(1)：90-94.

[26] 劉晶晶,汪蘋,王歡.一株異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌的脫氮性能研究[J].環(huán)境科學(xué)研究,2009,21(3)：121-125.

[27] 馬放,王弘宇,周丹丹,等.好氧反硝化菌株 X31的反硝化特性[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,33(7)：42-46.

[28] GUPTA A B.Thiosphaeera pantotropha a sulphur bacterium capable of simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification[J].Enzyme and Microbial Technology,1997,21(8)：589-595.

[29] TIMMERMANS P,VAN HAUTE A.Fundamental study of the growth and denitrification capacity of Hyphom icrobium sp.[J].Water Res,1983,17(10)：1249-1255.

[30] 馬放,周丹丹,王宏宇,等.一株好氧反硝化細(xì)菌生理生態(tài)特性的研究[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,38(4)：576-577.

[31] 閻勝利,溫淑瑤.土壤中反硝化作用的試驗(yàn)研究[J].河海大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,1998,26(2)：90-94.

[32] ZUMFTW G.Cell biology and molecular basis of denitrification[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1997,61(4)：533-616.

[33] YOSHIE S,NODA N,TSUNEDA S,et al.Salinity decreases nitrite reductase gene diversity in denitrifying bacteria of wastewater treatment systems[J].App l Environ Microbiol,2004,70(5)：3152-3157.

[34] JOONG K K,KYOUNG J P,KYOUNG S C,et al.Aerobic nitrification-denitrification by heterotrophic Bacillus strains[J].Bioresource Technology,2005,96(17)：1897-1906.

Screening of Aerobic Denitrifying Bacillus and Study on Denitrification Characteristics

AN Jian,SONG Zeng-fu,YANGXian-le,HUANG Zhi-hua,ZHANGXiao-neng
State Collection Center of Aquatic Pathogen,College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai
201306,China

Many Bacillus strains with aerobic denitrification character were isolated from the water and sediment of shrimp culture ponds.Among them,the Bacillus YX-6 could degrade nitrite nitrogen from 10 mg/L to zero in 14 h,aswell as app roximately 100%of nitrite nitrogen removal rate at a DO mass concentration of 5.2-5.8 mg/L.Furthermore,in comparison with the denitrifying Bacillus selected as the positive control,the denitrification characteristics of Bacillus YX-6 were tested under different pH,temperature,nitrite concentration and salinity.The results showed that the aerobic denitrification characteristics of Bacillus YX-6 were significantly higher than those of thepositive control(P＜0.05).According tomorphological observation,physiological and biochemical properties,and 16S rDNA molecular identification,the Bacillus YX-6 was identified p rimarily as Bacillus coagulans.

aerobic denitrification;Bacillus;nitrite

X17

A

1001-6929(2010)01-0100-06

2009-06-08

2009-08-20

國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (nyhyzx07-042);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(nycyts-49-17)

安健 (1983 -),男,內(nèi) 蒙 古 呼 和 浩 特 人,anjian520@sohu.com.

＊責(zé)任作者,楊先樂(lè) (1948-),男,湖南桃源人,教授,博導(dǎo),主要從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫、魚(yú)類藥理學(xué)與漁藥的檢測(cè)與監(jiān)控、水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制的理論與技術(shù)研究,xlyang@shou.edu.cn

(責(zé)任編輯：潘鳳云)