乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中AQP1、HIF-1α、VEGF的表達(dá)及意義

薛洪燕 施紅旗 陳志梅 王瑞權(quán)

(1.金華市人民醫(yī)院,浙江 金華 321000;2.金華市中心醫(yī)院,浙江 金華 321000)

水的跨膜轉(zhuǎn)運是細(xì)胞生存和生長的必要條件,水通道蛋白(aquaporin,AQP1)是近年發(fā)現(xiàn)的一類高效轉(zhuǎn)運水分子的特異孔道,它與水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運關(guān)系密切[1],水通道蛋白1(AQP1)廣泛存在于動物、植物及微生物中,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水跨膜轉(zhuǎn)運。惡性腫瘤細(xì)胞具有無限增殖、異常分化、快速生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等諸多特性,其細(xì)胞形態(tài)和功能的改變離不開水的參與,甚至比正常細(xì)胞更需要水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運。新近研究證實,AQP1對腫瘤演進(jìn)具有重要作用[2],提示AQP1與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

局部缺氧是實體腫瘤微環(huán)境普遍存在的一種現(xiàn)象,缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1能與多種靶基因上的缺氧反應(yīng)元件相結(jié)合,進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而提高腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的生存率。研究證實,HIF-1為腫瘤信號傳導(dǎo)的重要因子,與腫瘤演變關(guān)系密切[3-4]。HIF-1能激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的轉(zhuǎn)錄活性,這三種分子是否存在內(nèi)在聯(lián)系,以及如何相互作用,國內(nèi)外均少見報道。為此,作者通過檢測120例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中AQP1、HIF-1α及VEGF的表達(dá)水平,初步探討三者的臨床意義及相互間是否存在相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集金華市人民醫(yī)院及金華市中心醫(yī)院1995年1月～2004年12月120例診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的存檔組織蠟塊,均為女性患者,每例均有詳細(xì)臨床資料、手術(shù)記錄及5年以上的隨訪結(jié)果。術(shù)前均未接受化療和放療?；颊吣挲g24～76歲,中位年齡47.8歲。標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定。按Elston和Ellis評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級,I級69例,II級41例,III級 10例;按TNM 分期,I期44例,II期57例,III期19例。42例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,無轉(zhuǎn)移者78例。生存時間≥5年者91例,＜5年者29例,5年生存率75.8%。12例乳腺腺病為同期外科送來的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測實驗步驟 4μ m厚切片,脫蠟至水,采用免疫組織化學(xué)EnvisionTM二步法,置于3%H2O2內(nèi)5分鐘滅活內(nèi)源性過氧化物酶?？乖迯?fù)后,自然冷卻20分鐘,滴加一抗,4℃冰箱過夜,PBS沖洗,2分鐘×3次;滴加二抗-HRP多聚體,37℃溫箱內(nèi)孵育20分鐘,PBS沖洗2分鐘×3次;DAB顯色,蒸餾水沖洗、蘇木素襯染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封固。

1.2.2 免疫組化主要試劑 鼠抗人AQP1的多克隆抗體為美國Santa cruz公司產(chǎn)品,抗體按1:100稀釋后應(yīng)用。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司,鼠抗人VEGF多克隆抗體及免疫組化染色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判斷 AQP1陽性結(jié)果判定:細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上存在棕黃或棕褐色顆粒判為AQP1陽性細(xì)胞,選背景清晰陽性表達(dá)效果好的切片作統(tǒng)計學(xué)分析。每張切片隨機選擇5～10個高倍視野,計數(shù)1000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞取其平均數(shù)作為陽性細(xì)胞表達(dá)率。HIF-1α陽性僅定位于細(xì)胞核內(nèi),呈棕黃色。高倍鏡(10×40倍)下對每張切片隨機選擇5個視野,每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,共計1000個腫瘤細(xì)胞。無陽性細(xì)胞為陰性(-),陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為(+),10%～50%為(++),＞50%為(+++)。VEGF陽性細(xì)胞為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒沉著細(xì)胞。在高倍鏡(10×40倍)下對每張切片隨機選擇5個視野,計數(shù)200個細(xì)胞/視野,共計1000個,計算陽性細(xì)胞百分比=陽性細(xì)胞數(shù)/計數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%。無染色或陽性細(xì)胞百分比＜10%為陰性(-),陽性細(xì)胞數(shù)10%～30%為(+),30%～50%為(++),＞50%為(+++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS11.0軟件包,計數(shù)資料不同組間比較用卡方檢驗,計量資料用t檢驗,應(yīng)用 spearman 等級相關(guān)檢驗對 AQP1、HIF-1α、VEGF表達(dá)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 AQP1的表達(dá) AQP1主要表達(dá)于腫瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞,乳腺腺病組織中無AQP1表達(dá)。乳腺IDC與乳腺腺病組織相比,AQP1表達(dá)差異有顯著性(t=23.862,P＜0.01)。AQP1表達(dá)與乳腺IDC的腫塊大小(t=23.990,P＜0.01)、TNM分期(t=23.857,P＜0.01)、組織學(xué)分級(t=23.835,P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(t=23.981,P＜0.01)和腫瘤壞死與否(t=23.985,P＜0.01)有關(guān),兩者或三者之間有顯著性差異,而與患者年齡和術(shù)后5年生存率無關(guān)(P＞0.05),見表1。

2.2 HIF-1α的表達(dá) HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核,其陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)于腫瘤邊緣或與正常組織交界處,在壞死的腫瘤組織周圍的癌細(xì)胞中陽性表達(dá)尤為明顯,乳腺IDC組織中HIF-1α表達(dá)陽性率為44.2%,12例乳腺腺病組織中HIF-1α表達(dá)均陰性,乳腺IDC和乳腺腺病組織相比,HIF-1α表達(dá)差異有顯著性(χ2=11.16,P＜0.01)。HIF-1α表達(dá)率與乳腺IDC的腫塊大小(t=22.392,P＜0.01)、TNM分期(t=20.793,P＜0.01)、組織學(xué)分級(t=6.035,P＜0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(t=10.606,P＜0.01)和腫瘤壞死與否(t=21.541,P＜0.01)有關(guān),兩者或三者之間有顯著性差異,而與患者年齡和術(shù)后5年生存率無關(guān)(P＞0.05),見表1。

2.3 VEGF的表達(dá) VEGF表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì),乳腺IDC組織中VEGF表達(dá)陽性率為62.5%,12例乳腺腺病組織中VEGF表達(dá)均陰性,乳腺IDC和乳腺腺病組織相比,VEGF表達(dá)差異有顯著性(χ2=13.76,P＜0.01)。VEGF表達(dá)率與乳腺IDC的腫塊大小(χ2=9.163,P ＜0.01)、TNM 分期(χ2=11.362,P＜0.01)、組織學(xué)分級(χ2=11.408,P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(χ2=11.966,P＜0.01)和腫瘤壞死與否(χ2=18.020,P＜0.01)有關(guān),兩者或三者之間有顯著性差異,而與患者年齡和術(shù)后5年生存率均無關(guān)(P＞0.05),見表1。

2.4 乳腺IDC組織HIF-1α與AQP1和 VEGF表達(dá)的相關(guān)性 AQP1與HIF-1α、VEGF兩兩比較呈正相關(guān)(r=0.555,r=0.495,r=0.377,均 P＜0.01)。

3 討 論

局部缺氧是包括乳腺癌在內(nèi)的實體腫瘤普遍存在的一種現(xiàn)象,也是實體瘤微環(huán)境的基本特征,同時腫瘤細(xì)胞缺氧也成為腫瘤惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動因子。HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,能激活多種基因的轉(zhuǎn)錄活性,這些基因的蛋白產(chǎn)物包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、內(nèi)皮素1(endotheltin-1)、糖酵解酶等,進(jìn)而參與維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新血管生成、促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[5]。大多數(shù)腫瘤表現(xiàn)為更高的血管滲透性及細(xì)胞間質(zhì)液壓力的增高,導(dǎo)致局部缺氧,缺氧可直接刺激HIF-1表達(dá)升高。本組檢測結(jié)果顯示,12例乳腺腺病組織中均未見HIF-1α的表達(dá),而乳腺IDC陽性表達(dá)率為44.2%,并與乳腺IDC的腫塊大小、TNM分期、組織學(xué)分級、腫瘤壞死和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);同時發(fā)現(xiàn),在乳腺IDC的壞死區(qū)周圍更易見到HIF-1α陽性細(xì)胞,同時這些區(qū)域的AQP1也都高表達(dá),另外,腫瘤浸潤的邊緣或間質(zhì)血管增生處HIF-1α往往呈陽性表達(dá),提示HIF-1α過表達(dá)往往伴隨血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移。

表1 乳腺腺病及乳腺IDC中AQP1、HIF-1α和VEGF表達(dá)

局部缺氧,也將影響細(xì)胞的能量代謝及細(xì)胞膜離子通道的功能,進(jìn)而可能影響細(xì)胞膜上水通道蛋白的功能。水通道蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織間水的跨膜轉(zhuǎn)運,可有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織間的液壓力,調(diào)節(jié)局部缺氧程度,間接影響HIF-1的表達(dá),可見,AQP1與HIF-1α之間可能存在著復(fù)雜的病理生理聯(lián)系。本組結(jié)果顯示,HIF-1α陽性表達(dá)組的AQP1陽性細(xì)胞表達(dá)率較HIF-1α陰性表達(dá)組明顯高,表明兩者在生化水平上存在一定的關(guān)聯(lián),在功能上可能存在相互作用機制。AQP1正常在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或胞膜中表達(dá),研究表明AQP1在許多腫瘤的血管生成過程中起重要作用[6]。本組結(jié)果顯示,AQP1在乳腺IDC的表達(dá)高于乳腺腺病的表達(dá),并且其表達(dá)與腫塊大小、TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤壞死有關(guān)。AQP1過表達(dá)表明腫瘤間質(zhì)中不僅有大量新生微血管,而且AQP1介導(dǎo)的水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運有助于水分及其攜帶的大量營養(yǎng)物質(zhì)通過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入到周圍的組織間隙中,滿足腫瘤細(xì)胞的生長代謝并為其向周圍組織侵襲浸潤提供充分的物質(zhì)基礎(chǔ)。Baluk等[7]有關(guān)腫瘤毛細(xì)血管上AQP1基因表達(dá)的研究提示,腫瘤異常血管的形成可能是通過增強血管的滲透性和組織間隙的壓力來實現(xiàn)的。VEGF是參與腫瘤血管生成的主要直接調(diào)控因子之一,有研究發(fā)現(xiàn)在VEGF基因轉(zhuǎn)錄起始點上游存在HIF-1α結(jié)合位點,HIF-1α可促進(jìn)VEGF基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,誘導(dǎo)血管形成[8]。本組結(jié)果顯示乳腺IDC組織中VEGF的陽性表達(dá)率明顯高于乳腺腺病組織,并與乳腺IDC的腫塊大小、TNM分期、組織學(xué)分級、腫瘤壞死和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。經(jīng)分析AQP1與HIF-1α、VEGF表達(dá)變化,結(jié)果顯示兩兩比較呈正相關(guān)(r=0.555、r=0.495、r=0.377,P＜0.01),推測通過AQP1介導(dǎo)的高滲透性引起流體靜力壓的增高,并且隨之引起缺氧,缺氧狀態(tài)下HIF-1α基因激活,通過調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)乳腺IDC組織中新生血管的生成。乳腺癌組織雌激素受體、孕激素受體、表皮生長因子受體靶分子信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機制的闡明,已深刻地揭示了其在乳腺癌演進(jìn)過程中的重要意義,已成為選擇治療策略的重要依據(jù)。通過乳腺癌組織中AQP1與HIF-1α、VEGF相關(guān)性研究,初步探討其間存在的關(guān)系,為進(jìn)一步探明生物靶分子之間相互作用的信號傳導(dǎo)機制,特別是尋找新的分子治療靶點,進(jìn)而為乳腺癌的防治提供有益幫助。

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