解脲支原體不同生物群別對(duì)小鼠體外受精的影響

武蓉珍 劉勝勇 陳東紅 周美青 金卓杏 張曉蘭 陳曉方 周麗紅 周鐵麗

解脲支原體(UU)是人類泌尿生殖道內(nèi)最常見(jiàn)的支原體,可分為 14個(gè)血清型。由于各血清型之間具有較高的抗原同源性,交叉反應(yīng)明顯,給 UU臨床分離株的血清分型工作及篩選有毒力的血清型株帶來(lái)一定的困難,而不同生物群之間的交叉反應(yīng)較少見(jiàn)。2002年,Robertson等[1]根據(jù)UU兩個(gè)生物群的表型和基因型特征,建議將兩者劃分為脲原體屬下兩個(gè)完全獨(dú)立的物種,提出了生物群概念。生物群 1(或 Parvo生物型)包括血清型 1,3,6和 14共計(jì) 4種含較小基因(DNA長(zhǎng)度 0.75～0.76Mbp)的 UU,生物群 2(或 T960生物型)則包括血清型 2,4,5,7,8,9,10,11,12和 13共 10種含較大基因(DNA長(zhǎng)度0.88～1.2Mbp)的UU。近年來(lái),解脲支原體的檢出率不斷上升,臨床上常常對(duì)宮頸分泌物、精液和前列腺液中檢測(cè)出 UU的就醫(yī)者盲目投以大量抗生素藥物,導(dǎo)致UU臨床分離株的耐藥性日益嚴(yán)重。生殖系統(tǒng)UU的致病性如何,UU是否只有某些生物群達(dá)到一定濃度時(shí),才能影響精子的授精能力和胚胎的發(fā)育,從而致病,目前尚無(wú)一個(gè)系統(tǒng)的、有說(shuō)服力的研究來(lái)證實(shí)這一點(diǎn)。人類配子的受精、卵裂、2～8細(xì)胞期的胚胎發(fā)育都在輸卵管中完成,此時(shí)若受到 UU感染將會(huì)對(duì)受精、卵裂及隨后的早期胚胎發(fā)育有何影響尚不明了。針對(duì)這一現(xiàn)象,我們用血清型 3型 UU代表含有較小基因的生物群 1(或 Parvo生物型),血清型 8型UU代表含有較大基因的生物群 2(或 T960生物型),分別與 ICR小鼠精子、成熟卵丘 -卵母細(xì)胞復(fù)合體共孵育,觀察不同生物群別的 UU對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞體外受精(IVF)及卵裂的影響。

材料與方法

一、標(biāo)準(zhǔn)菌株及動(dòng)物

解脲支原體血清型 3型(菌株號(hào)：ATCC27815)、血清型 8型(菌株號(hào)：ATCC27618)標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于南京東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室,傳代后 -80℃凍存?zhèn)溆谩Ｇ鍧嵓?jí)ICR小鼠,雌鼠 50只,5～8周齡,體重(25±5)g;成熟雄鼠 5只,10～16周齡,體重(30±5)g。由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、主要試劑與儀器

培養(yǎng)液 HTF和 HTF-HEPES為 InVitroCare公司產(chǎn)品;礦物油為 MediCult公司產(chǎn)品;血清替代品 SSS、磷酸鹽緩沖液(PBS)為Irvine公司產(chǎn)品;解脲支原體培養(yǎng)基購(gòu)于珠海麗珠試劑公司;孕馬血清促性腺激素 (PMSG)和人絨毛膜促 性腺激素 (HCG)為寧波第二激素制品廠產(chǎn)品;高純度(99.999%)CO2氣體為杭州新世紀(jì)氣體有限公司生產(chǎn)。體視顯微鏡、倒置顯微鏡、相差顯微鏡均為日本 Nikon公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為英國(guó) Galaxy公司產(chǎn)品;IVF工作站為丹麥 K-system系列產(chǎn)品。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.UU的菌數(shù)測(cè)定 采用顏色改變單位法(CCU),將菌液用培養(yǎng)基稀釋成 1×10-1～ 1×10-9系列濃度,經(jīng) 37℃恒溫培養(yǎng) 7d后,以培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色時(shí)的最高稀釋度作為顏色改變單位(CCU),菌液濃度以 CCU/ml計(jì)。

2.UU的培養(yǎng)方法 于取鼠卵前一天,取 -80℃凍存的UU標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),顏色由黃色變?yōu)槁陨畹募t色時(shí)將培養(yǎng)基離心,棄上清,加入 100μl平衡的 HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液中,輕輕吹打混勻。取 50μl作 CCU培養(yǎng),進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定,其余置培養(yǎng)箱中備用。

3.小鼠超促排卵方法和成熟卵丘 -卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCS)的獲得 根據(jù) Hogan等[2]采用的方法進(jìn)行小鼠卵子的超排。于注射HCG后 16～18h用頸椎脫臼法處死雌鼠,切取雙側(cè)輸卵管,在培養(yǎng)液中劃破,COCS自動(dòng)釋放后,將其移入HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液中,用細(xì)巴斯德管吹散,獲單個(gè)COCS。隨機(jī)分組后移入已平衡過(guò)夜的培養(yǎng)液中等待受精。

4.小鼠精子的采集及 IVF 選取健康的 8～10周齡的ICR雄鼠,處死后將附睪尾部及附帶的部分輸精管,置于 HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液中,劃破雄鼠附睪尾部,精子自然游出,置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1h使其獲能。將獲能后的精子用 Makler精子計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),并用 HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液調(diào)整濃度至 1×106～5×106個(gè)/ml。按精卵比 10 000：1的比例將精子加入含有卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行受精。

5.卵子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) Ⅰ級(jí)：卵細(xì)胞呈深色,放射冠完全沒(méi)有分散開(kāi),卵丘細(xì)胞緊密排列在一起,顏色偏深,卵丘細(xì)胞很小。常為不成熟或退化的卵子;Ⅱ級(jí)：卵細(xì)胞外觀顏色變淺,放射冠已呈不同程度的分散,卵丘細(xì)胞排列變疏松,顏色變淺。通常為已接近成熟的卵子;Ⅲ級(jí)：卵細(xì)胞外觀顏色很淡,形狀為規(guī)則的圓形,放射冠完全分散,卵丘細(xì)胞通常較大,排列疏松,顏色很淡。通常為成熟卵子;Ⅳ級(jí)：卵細(xì)胞顏色變深,放射冠分散,但外周卵丘細(xì)胞團(tuán)很小或缺失,通常為過(guò)熟卵子。選擇Ⅲ級(jí)卵子后續(xù)操作。

6.胚胎評(píng)分方法 對(duì)取卵后第 2天(D2組)或第 3天(D3組)胚胎分別按胚胎發(fā)育速度(細(xì)胞數(shù)目評(píng)分)、碎片程度和卵裂球?qū)ΨQ性進(jìn)行評(píng)估,計(jì)三者總分為一個(gè)胚胎的得分,具體評(píng)分方法見(jiàn)表 1。

表 1 胚胎質(zhì)量評(píng)分方法

7.不同生物群別 UU對(duì)小鼠IVF影響 實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的 3型或 8型 UU菌液,對(duì)照組不加 UU。按精卵比為10 000：1的比例將小鼠精子和COCS加入,培養(yǎng)過(guò)夜。第 2天,更換新鮮HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng) 72～75h,每天記錄胚胎生長(zhǎng)情況。統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的體外受精率、D2胚胎評(píng)分及4-細(xì)胞期胚胎形成率。

受精率(%)=(≥2-細(xì)胞期胚胎數(shù))/(獲卵數(shù))×100%

4-細(xì)胞期胚胎形成率(%)=(≥4-細(xì)胞期胚胎數(shù))/(獲卵數(shù))×100%

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 D2胚胎評(píng)分用(ˉx±s)表示,兩組間胚胎評(píng)分的比較用t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間受精率、4-細(xì)胞期胚胎形成率的比較采用 χ2檢驗(yàn),采用 SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

一、各濃度 3型 UU對(duì)小鼠 IVF影響

3型UU在培養(yǎng)液中的終濃度分別為 104CCU/ml組(104組)、105CCU/ml組(105組)、106CCU/ml組 (106組)的 D2評(píng)分、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。105組和106組的受精率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

表 2 3型 UU各組 IVF情況比較

二、各濃度 8型 UU對(duì)小鼠 IVF影響

8型 UU在培養(yǎng)液中的終濃度為 102CCU/ml組(102組)的受精率、D2評(píng)分、4-細(xì)胞期胚胎形成率等胚胎發(fā)育指標(biāo)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。UU終濃度分別為 104CCU/ml組(104組)、105CCU/ml組(105組)的受精率、D2評(píng)分、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。103CCU/ml組(103組)的受精率、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但其 D2評(píng)分與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),見(jiàn)表2。

表 3 8型 UU各組 IVF情況比較

討 論

UU是引起泌尿生殖道炎癥的最常見(jiàn)的病原體,也是性傳播疾病(STD)的主要病原體。在男性精液中,UU感染約占10%～40%,而在女性生殖道炎癥中檢出率高達(dá) 64.39%～67.40%[3]。已有較多的證據(jù)表明UU感染與男性的非淋菌性尿道炎、男性不育、前列腺炎、附睪炎,女性的流產(chǎn)、早產(chǎn)、不孕不育、女性急慢性生殖道炎癥,新生兒低體質(zhì)量等均有較密切的關(guān)系。UU感染已引起臨床的高度關(guān)注,其致病性的相關(guān)因素值得探討。

有學(xué)者提出 14個(gè)血清型的致病力不盡相同[4],并非所有UU均具有致病性。有的血清型可以作為宿主正常攜帶的微生物,甚至在沒(méi)有性生活的幼女陰道內(nèi)也存在。史同新等[5]發(fā)現(xiàn)在 1～3歲健康幼兒泌尿生殖道中 UU的攜帶率為8.0%,以生物群 1為主,主要血清型是 1型和 6型。國(guó)內(nèi)王荷英等[6]對(duì) 172株 UU進(jìn)行血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：4型與非淋菌性尿道炎顯著相關(guān),3型在宿主因素和一定的環(huán)璄條件下,UU的寄居和致病狀態(tài)可相互轉(zhuǎn)化。Yoshida等[7,8]認(rèn)為,UU的T960生物型中2,5,8,9四種血清型與非淋菌性尿道炎有相關(guān)性,提出UU的 T960生物型可能是非淋菌性尿道炎的病原體,而Parvo生物型則可能在非淋菌性尿道炎的發(fā)生發(fā)展中沒(méi)有意義。朱慶義等[9]發(fā)現(xiàn)：性病門診患者臨床標(biāo)本中 UU陽(yáng)性率 56.8%,其中 3型最多,占 16.7%,1型占 13%。而權(quán)力敏等[10]學(xué)者研究表明,血清型 3,4,10,11與感染有關(guān),血清型 6,14則以寄居形式在體內(nèi)呈攜帶狀態(tài)而不致病。因此,探討 UU不同血清型與致病性關(guān)系有重要的理論和實(shí)踐意義。人精液質(zhì)量與 UU感染的生物群也有關(guān),T960群感染可引起精子活動(dòng)力明顯下降。2003年 Ren等[11]運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行 UU基因分型,揭示正常攜帶狀態(tài)及感染狀態(tài)下 UU的基因型。認(rèn)為Parvo生物型,尤其是 1,3,6的單型別,在正常人群攜帶的可能性較大,而 T960生物型有可能和Parvo生物型中 1種以上血清型起協(xié)同作用或獨(dú)自導(dǎo)致疾病。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：3型UU濃度≤103CCU/ml、8型 UU濃度≤102CCU/ml時(shí),受精率、D2評(píng)分、4-細(xì)胞期胚胎形成率等胚胎發(fā)育指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)差異(P＞0.05);3型UU濃度≥105CCU/ml、8型 UU濃度≥ 104CCU/ml時(shí),受精率、D2評(píng)分、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對(duì)照組比較均有差異(P﹤0.01);而當(dāng) 3型 UU濃度為 104CCU/ml、8型 UU濃度為103CCU/ml時(shí),受精率與對(duì)照組比較無(wú)差異,但 D2評(píng)分、4-細(xì)胞期胚胎形成率出現(xiàn)了差異,說(shuō)明這一濃度為UU對(duì)小鼠的IVF造成抑制作用的臨界濃度,雖然受精率沒(méi)受到影響,但胚胎發(fā)育潛力受到抑制。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,隨著UU濃度的增高,對(duì)小鼠IVF及早期胚胎發(fā)育的影響也增大。UU的致病性與其血清型有關(guān),代表含有較大基因的生物群 2(或T960生物型)的血清型 8型UU可能較代表含有較小基因的Parvo生物型的血清型 3型UU具有更強(qiáng)的致病性。這與文獻(xiàn)報(bào)道 T960生物群可能是致病菌群,而 Parvo生物群可能是定植菌群有些相符[12,13],但 3型 UU并非不具有致病性,這可能與實(shí)際的臨床病例標(biāo)本中 Parvo生物型 UU未達(dá)到本實(shí)驗(yàn)研究中那么高的濃度有關(guān),也與觀察的方法和卵細(xì)胞的受精及其早期胚胎的發(fā)育對(duì)外界環(huán)境的敏感性高有關(guān)。低濃度的UU(3型 UU≤103CCU/ml、8型 UU≤102CCU/ml)對(duì)小鼠 IVF及早期胚胎發(fā)育未見(jiàn)影響,但其遠(yuǎn)期效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

由于卵子質(zhì)量對(duì) IVF的結(jié)果影響很大,因此在實(shí)驗(yàn)中必須選擇卵子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為Ⅲ級(jí)的成熟卵子進(jìn)行隨機(jī)分組,在卵丘 -卵母細(xì)胞復(fù)合體自動(dòng)釋放后嚴(yán)格去除卵細(xì)胞外觀顏色發(fā)黑的、形狀不規(guī)則的、卵丘細(xì)胞稀少的卵子。解脲支原體的培養(yǎng)基與胚胎培養(yǎng)基成分不同,對(duì)精子、卵子、胚胎均有一定的損害,因此一定要用高速離心法濃縮UU,并充分去除殘余的支原體培養(yǎng)基,再用經(jīng)平衡的胚胎培養(yǎng)基洗滌后再加入培養(yǎng)系統(tǒng),以排除支原體培養(yǎng)基對(duì)小鼠 IVF和早期胚胎發(fā)育的影響。

綜上所述,UU的致病性毒力與其生物群、濃度密切相關(guān),在臨床應(yīng)用上,分子檢測(cè)方法有望成為病原學(xué)診斷的常規(guī)方法[14]。但目前UU臨床檢測(cè)手段仍然有限,對(duì)UU致病性仍未最終定性,應(yīng)嚴(yán)格 UU感染的診斷,建立一個(gè)簡(jiǎn)單、實(shí)用、可靠的UU分型的臨床檢測(cè)方法,避免過(guò)度治療和耐藥株的日益增多。

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