基因組原位雜交技術(shù)在大麻育種中的初步應(yīng)用

張利國(guó)

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是分子生物學(xué)和組織化學(xué)、細(xì)胞學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，該技術(shù)在20世紀(jì)80年代末首先用來分析黑麥（Rye）的野生雜種雙親基因組的分布。

基因組原位雜交技術(shù)（genomic in situ hy-bridization，GISH）是熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)一步的發(fā)展，它是利用標(biāo)記物標(biāo)記基因組總DNA，以其作探針與染色體制片進(jìn)行原位雜交檢測(cè)目標(biāo)DNA的一種技術(shù)。廣泛應(yīng)用于對(duì)不同物種之間的基因組進(jìn)行研究[1]；研究基因組結(jié)構(gòu)及其空間排布規(guī)律[2]；研究物種的起源與進(jìn)化[3]；檢測(cè)外源滲入染色體或染色體片段[4]等生物學(xué)研究的各領(lǐng)域。

熒光原位雜交技術(shù)是分子細(xì)胞遺傳學(xué)建立的基礎(chǔ)，具有其它分子生物學(xué)和細(xì)胞方法無法比擬的直觀性、準(zhǔn)確性，這一技術(shù)將為大麻親緣關(guān)系的演化研究，特別是為大麻性染色體的研究發(fā)揮重要作用。影響染色體原位雜交成功與否的因素有很多，如染色體制片的質(zhì)量、探針的長(zhǎng)度及與封阻的比例以及染色體的變性溫度與時(shí)間等都影響著熒光原位雜交的效果。本研究以大麻為材料，確定這些因素的最佳組合，建立大麻的基因組原位雜交體系，并應(yīng)用于亞麻基因組導(dǎo)入大麻染色體組的鑒定。

熒光原位雜交技術(shù)對(duì)研究花粉管通道法的轉(zhuǎn)化途徑和轉(zhuǎn)化機(jī)制具有重要意義。目前，研究者利用熒光原位雜交等技術(shù)，已能檢測(cè)轉(zhuǎn)移結(jié)果，如檢查外源基因是否存在于受體細(xì)胞核內(nèi)，是否整合于染色體上，整合在哪一條染色體上以及外源基因是否表達(dá)等[5]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

亞麻品種戴安娜，大麻品種五常40。2008年采用花粉管導(dǎo)入法將亞麻品種戴安娜的DNA導(dǎo)入大麻品種五常40，2009年經(jīng)大田鑒定，獲得形態(tài)變異明顯的導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)材料9份。

1.2 染色體制片

采用植物染色體去壁低滲法[6]。種子用蒸餾水浸泡24h，在25℃恒溫保濕培養(yǎng)，等待根尖長(zhǎng)出1cm左右，切取放入1.5%的對(duì)二氯苯溶液中，在10℃條件下預(yù)處理5h，卡諾溶液固定12h，轉(zhuǎn)入70%酒精中4℃?zhèn)溆?。制片前，將根尖置于雙蒸水中低滲20min，用混合酶液（4%纖維素酶與1%果膠酶）37℃處理30min，不染色，采用火焰干燥法制片，在相差顯微鏡下鏡檢，將分散良好清晰的染色體標(biāo)本置于液氮中15分鐘，用于原位雜交實(shí)驗(yàn)。

1.3 總基因組DNA的提取與探針的標(biāo)記

采用常規(guī)CTAB法提取戴安娜和五常40基因組，用分光光度計(jì)測(cè)量所提取DNA的純度和濃度，分裝，放-20℃保存。取亞麻總DNA100微升（濃度在50ng/ul以上即可），用超聲波碎儀處理30秒到1分鐘。用生物素標(biāo)記探針十分穩(wěn)定，可在TE緩沖液、-20℃條件下保存至少一年。

1.4 原位雜交

1.4.1 預(yù)處理

載片在60℃恒溫箱中處理3小時(shí)或過夜，每張載片加100ul Rnase，37℃濕盒中處理1小時(shí)。室溫下，2×SSC清洗10分鐘。每張載片加200ul胃蛋白酶（含0.01%胃蛋白酶的10mol/LHCL），37℃溫浴5分鐘。1×PBS洗滌2×5min，然后放入4%的多聚甲醛中10min。2×SSC洗滌2min。在40ml的70%甲酰胺（溶于2×SSC，pH7.0）70℃變性2分鐘。依次在冷的70%、85%、95%、100%乙醇中脫水，各3分鐘，氣干。

1.4.2 雜交混合液制備

制備雜交混合液：按每張標(biāo)本加20ul配置雜交液，在冰上制備，含探針DNA 30～60ng，封阻DNA，鮭精DNA，10%SDS，20%硫酸葡聚糖/甲酰胺。封阻DNA的制備：大麻總基因組DNA，1.05Mpa滅菌5分鐘。

用于探針的DNA純度很重要，因?yàn)閷?duì)任何標(biāo)記系統(tǒng)來說，提取的DNA越純，經(jīng)標(biāo)記形成探針的質(zhì)量越好。經(jīng)紫外分光度計(jì)測(cè)定，DNA的純度值在1.8～2.0之間才符合要求。

本研究以亞麻總DNA為探針進(jìn)行雜交，選用缺口平移法，因它產(chǎn)生的探針片段大?。?00～600bp）易于穿透組織。但標(biāo)記的時(shí)間要嚴(yán)格控制，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則由于DNA聚合酶本身的外切酶活性會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記效率的降低。本實(shí)驗(yàn)采用15-16℃溫育2個(gè)小時(shí)。

影響熒光原位雜交成功與否的另一重要因素是探針與封阻DNA比例及封阻DNA片段長(zhǎng)度大小。封阻DNA的作用是通過優(yōu)先與靶染色體上共有保守序列雜交，使剩下的特異性序列為標(biāo)記探針?biāo)s交。探針DNA與封阻DNA的比例也是影響原位雜交信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)鍵因素之一。封阻DNA的濃度過高或過低均不會(huì)獲得較好的原位雜交效果。一般來說，兩個(gè)物種的親緣關(guān)系越近，則要采用較高濃度的封阻DNA；親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，封阻DNA的濃度降低，甚至可不用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)記基因組總DNA與封阻基因組總DNA（200～400 bp）的濃度比例為1：200時(shí)，能有效分開大麻與亞麻的基因組。

1.4.3 變性與雜交

將雜交混合液置于95～100℃下處理10分鐘，立刻置于冰上冷卻。將雜交混合液加在已變性的載片上（預(yù)熱37℃），每張18ul，蓋上蓋玻片，玻片四周用膠水封住，防止長(zhǎng)時(shí)間高溫雜交液成分變化。置于80℃下共變性6分鐘。將載片放入濕盒中，37℃下雜交過夜。

對(duì)原位分子雜交來說變性包括兩部分：染色體變性和雜交混合液變性?，F(xiàn)在普遍采用的是熱變性，但溫度過高會(huì)使染色體嚴(yán)重變形，膨脹或邊緣模糊不清。解決這一矛盾的方法是采用70℃、70%甲酰胺變性2分鐘，為更好保持染色體形態(tài)，載片可在變性后經(jīng)系列冷乙醇脫水。雜交混合液的變性不涉及形態(tài)問題，因此這一變性條件變動(dòng)很大。本實(shí)驗(yàn)采用95～100℃變性10分鐘，變性后迅速冰浴10分鐘。

1.4.4 檢測(cè)和觀察

（1）用洗液1（50%甲酰胺），42℃沖洗三次，每次5分鐘；再用0.1×SSC 60℃沖洗三次，每次5分鐘。

（2）在37℃100ul 3%BSA中溫浴20分鐘（以下步驟避光操作）；

（3）在 37℃ 90ul FITIC-AvidinD（Vecter；A-2001）溫浴 30-40 分鐘；

（4）用洗液2（0.1%Tween20）42℃沖洗三次，每次3分鐘；

（5）在 37℃ 100ul Biotinylated goat anti-avidinD（Vecter；BA-0300）中溫浴 30-40 分鐘；（6）用洗液2 42℃沖洗三次，每次3分鐘；

（7）在 37℃ 90ul FITIC-AvidinD（Vecter；A-2001）溫浴 30-40 分鐘；

（8）用洗液2 42℃沖洗三次，每次3分鐘

（9）用蒸餾水快速?zèng)_洗，在每張載片上滴加40ul DABCO和PI的混合液，暗處保存30分鐘；

（10）用蒸餾水沖洗干凈，滴加18ul抗褪變劑。

（11）用OlympusBH-2熒光顯微鏡觀察。FITIC和PI的熒光信號(hào)分別采用B激發(fā)濾光片和G激發(fā)濾光片組檢測(cè)。將觀察到的信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)數(shù)字化，用相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件調(diào)節(jié)對(duì)比度和亮度，進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

在熒光顯微鏡下，用PI反染的染色體呈紅色熒光，生物標(biāo)記的探針經(jīng)用熒光劑FITC檢測(cè)之后呈現(xiàn)黃綠色。

使用亞麻探針與亞麻染色體雜交，結(jié)果如圖1，30條染色體均呈現(xiàn)出黃綠色信號(hào)，而對(duì)照（雜交液中不含探針）只有紅色熒光，表明標(biāo)記的探針是有效的。

使用亞麻探針與正常大麻染色體雜交，均只呈現(xiàn)出紅色熒光信號(hào)如圖2。使用亞麻探針與9份導(dǎo)入亞麻DNA的大麻染色體雜交，其中7份只有紅色熒光信號(hào)，2份材料08-31，08-34有綠色熒光信號(hào)，如圖3和圖4，材料08-31有4個(gè)染色體出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)（箭頭處），08-34有2條染色體檢出綠色熒光信號(hào)（箭頭處）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明9份將亞麻戴安娜DNA導(dǎo)入大麻五常40的材料中，有2份材料含有亞麻的遺傳物質(zhì)，并且導(dǎo)入部位都是染色體端部，這可能與大麻的基因多集中在染色體端部有關(guān)。

3 討論與展望

染色體原位雜交，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，影響的因素較多，除受探針的制備、探針與封阻DNA的比例和變性因素的影響外，染色體制片也是重要的影響因素。

首先保證較高的中期分裂相能提高雜交的成功率，一般每張載片要求10個(gè)分裂相以上，同時(shí)要求染色體從細(xì)胞膜中分散出來并可以計(jì)數(shù)，以便去除殘余細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁對(duì)染色體的遮蓋。此外，染色體長(zhǎng)度及凝聚狀態(tài)是影響原位雜交分辯率的又一重要因素，在決定原位雜交分辨率的因素中，最重要的是所使用的靶DNA在染色體或DNA纖維上的濃縮，亦即DNA在染色體結(jié)構(gòu)或DNA纖維上的三維空間包裹程度，濃縮度越高，分辨率越低，如染色體過短則DNA致密，可能無法確定重復(fù)序列在染色體上的不同位置的空間關(guān)系；在基因組原位雜交中，由于染色體的高度凝聚，將使雜交信號(hào)縮小，不利于小片段DNA序列的辨別。因此，今后研究重點(diǎn)之一就是如何另外提高染色體的伸展程度，目前Fiber-fish的出現(xiàn)已顯著提高了原位雜交的分辨率。此外，能否獲得清晰圖像，與洗脫強(qiáng)度有很大的關(guān)系，因此在雜交過程中每個(gè)步驟要保證適當(dāng)?shù)南疵搹?qiáng)度。

圖1 亞麻探針與亞麻染色體雜交Fig.1 The hybrid offlaxprobe and flaxchromosome

圖2 亞麻探針與正常大麻染色體雜交Fig.2 The hybrid offlaxprobe and normal hemp chromosome

圖3 亞麻探針對(duì)材料08-31的檢測(cè)Fig.3 The hybrid offlaxprobe and 08-31

圖4 亞麻探針對(duì)材料08-34的檢測(cè)Fig.4 The hybrid offlaxprobe and 08-34

利用原位雜交進(jìn)行DNA序列的定位具有實(shí)驗(yàn)周期短、靈敏度高、分辨率高、直觀可見等優(yōu)點(diǎn)。大麻的性別分化是制約大麻發(fā)展的重要因素，利用原位雜交技術(shù)可以將大麻性別相關(guān)基因或序列定位于染色體上，對(duì)其具體功能進(jìn)行深入的研究，同時(shí)原位雜交的在研究大麻的親緣關(guān)系、以及大麻轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)和遺傳圖譜的構(gòu)建上都將發(fā)揮重要作用。

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