四季桂花瓣色素的初步鑒定與提取方法

蔡 璇，蘇 蘩，金荷仙，姚崇懷，王彩云

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 園林學(xué)院，浙江 臨安 311300；3.《中國園林》雜志社，北京 100835）

桂花Osmanthus fragrans為原產(chǎn)中國的木犀科Osmanthaceae園林觀賞植物，享有 “獨占三秋壓眾芳”的美譽，其樹姿優(yōu)美，四季常綠，是中國傳統(tǒng)十大名花之一，不僅在園林中廣泛應(yīng)用，而且因其濃郁的芳香而成為中國重要的特產(chǎn)天然香料資源［1］。前人以花色作為重要的分類依據(jù)，將桂花分為花色較淡的銀桂品種群、黃色系的金桂品種群、橙色系的丹桂品種群及黃白色的四季桂品種群［2］。桂花花瓣色素方面的研究較少，僅有李志州等［3］、儲敏［4］、王桃云等［5］在色素提取與穩(wěn)定性方面以及陳洪國［6］將桂花開花進(jìn)程中花瓣色素的變化作為衰老指標(biāo)之一進(jìn)行的研究報道。桂花色素鑒定和提取的實驗體系尚不夠完善，阻礙了桂花花瓣色素形成與結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究。因此，本研究以四季桂Osmanthus fragrans‘Siji Gui’為材料，旨在探索其優(yōu)化的花瓣色素鑒定條件以及黃酮類化合物和類胡蘿卜素的提取方法，為進(jìn)一步開展桂花其他相關(guān)色素鑒定、提取和結(jié)構(gòu)與代謝的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料四季桂于2008年10月采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。采樣樹為樹齡40～50 a的健康植株，無病蟲害。選取盛花期、黃白色的花朵進(jìn)行采摘。采后花瓣放于－70℃冰箱［5］，試驗前置50～60℃烘箱中烘干，研成粉末后放于牛皮紙袋中于室溫下避光干燥保存待用［7］。

1.2 四季桂花瓣色素的初步鑒定

1.2.1 四季桂花瓣色素的顏色反應(yīng)法鑒定 參考白新祥等［8］方法，準(zhǔn)確稱取桂花花瓣粉末3份各0.1 g放于3個具塞試管中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%的氨水、體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸和石油醚5 mL，觀察并記錄試驗反應(yīng)。

1.2.2 四季桂花瓣色素的紫外-可見光譜法鑒定 參考王桃云等［5］方法，準(zhǔn)確稱取桂花花瓣粉末6份各0.1 g放于6個具塞試管中，分別加入甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、丙酮 ∶乙醇（1∶1）、丙酮 ∶石油醚（1∶1）各10 mL，室溫下浸提1 h后，將色素提取液放置于1 cm石英比色皿中，用SHIMADZU UV-2450紫外可見分光光度計在190～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3 四季桂花瓣色素的提取

1.3.1 四季桂花瓣黃酮類化合物的提取 稱取15份四季桂花瓣粉末各0.01 g，分別以體積分?jǐn)?shù)為25%，50%，75%，90%和100%的甲醇、乙醇和丙酮溶液［5］于室溫下浸提1 h，用于比較不同試劑的提取效果；稱取5份花瓣粉末各0.01 g，以10 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液作為提取劑，在室溫下分別浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，用于比較不同時間的提取效果；室溫下按料液比（花瓣粉末單位為 g，提取劑單位為 mL）1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90和1∶100，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡花瓣粉末1 h，用于比較不同料液比的提取效果；稱取5份花瓣粉末各 0.01 g，在室溫 25，30，45，60和75℃下各用10 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸提1 h，用于比較不同溫度的提取效果。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9（34）正交表對提取條件進(jìn)行優(yōu)化（表1）。以上各試驗重復(fù)3次，濾液在黃酮類化合物的特征吸收峰 320 nm 處測定吸光值［9－10］。

表1 四季桂花瓣黃酮類色素提取的正交試驗因素水平表 L9（34）Table 1 Petal flavonoids extracting orthogonal test factor level L9（34）of Osmanthus fragrans‘Siji Gui’

1.3.2 四季桂花瓣類胡蘿卜類色素的提取 稱取5份花瓣粉末各0.5 g，分別用10 mL的石油醚、乙酸乙酯、丙酮 ∶乙醇（1∶1）、丙酮∶石油醚（1∶1）和石油醚 ∶乙醇（1∶1）溶液［5］于室溫下浸提1 h，用于比較不同試劑的提取效果；稱取6份花瓣粉末各0.5 g，以10 mL乙醇 ∶丙酮（1∶1）溶液作為提取劑，在室溫下分別浸提 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，用于比較不同時間的提取效果；室溫下按料液比（花瓣粉末單位為g，提取劑單位為mL）為1∶20，1∶40，1∶60，1∶80和 1∶100，用乙醇 ∶丙酮（1∶1）溶液浸泡花瓣粉末 1 h，用于比較不同料液比的提取效果；稱取5份花瓣粉末各0.5 g，在室溫25，30，45，60和75℃下各用10 mL乙醇 ∶丙酮（1∶1）溶液浸提1 h，用于比較不同溫度的提取效果；根據(jù)單因素試驗結(jié)果，用L9（34）正交表對提取條件進(jìn)行優(yōu)化（表2）。以上各試驗重復(fù)3次，濾液在葉黃素、番茄紅素和胡蘿卜素的紫外最大吸收峰 443，472，502 nm 處測定吸光值［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 四季桂花瓣色素的初步鑒定

向四季桂花瓣的色素提取液中加入石油醚，浸提液表現(xiàn)為淺亮黃色，說明四季桂花瓣中含有類胡蘿卜素；加入體積分?jǐn)?shù)10%鹽酸，浸提液呈現(xiàn)黃色，說明其中含有黃酮類化合物；加入體積分?jǐn)?shù)30%氨水，浸提液呈現(xiàn)銹黃色，說明其中含有黃酮醇類化合物［8］。

表2 四季桂花瓣類胡蘿卜類色素提取的正交試驗因素水平表 L9（34）Table 2 Petal carotenoids extracting orthogonal test factor level L9（34）of Osmanthus fragrans‘Siji Gui’

2.2 四季桂花瓣的吸收光譜特征

從圖1可知，四季桂花瓣色素提取液的最高吸收峰在320 nm處，為黃酮類化合物的特征吸收峰。以丙酮 ∶乙醇（1∶1）作為提取試劑時，浸提液在類胡蘿卜素的特征吸收峰處有波動現(xiàn)象，表明可能含有少量類胡蘿卜素［11］。

圖1 四季桂花瓣色素浸提液吸收光譜特征圖Figure 1 Absorption spectra characteristic of O.fragrans‘Siji Gui’petal pigment

2.3 四季桂花瓣黃酮類化合物的提取

2.3.1 提取劑、提取時間、溫度與料液比等單因素試驗 由表3可知，甲醇和乙醇對桂花色素的提取效果較好，丙酮較差。不同體積分?jǐn)?shù)的溶劑提取效果也不同。其中，體積分?jǐn)?shù)為25%甲醇提取效果雖好，但甲醇有毒，一般不采用［12］；用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇提取效果也很好，但時間長了容易將葉綠素提取出來［13］，所以應(yīng)采用體積分?jǐn)?shù)較低的乙醇溶液作為提取試劑。由圖2可見，提取時間為3 h時，提取效果最好；料液比在1∶20～40時對黃酮類化合物的提取效果最好；隨著溫度的升高，吸光度逐漸增大，但由于乙醇的沸點是78.5℃，所以提取溫度應(yīng)在乙醇的沸點以下。

2.3.2 黃酮類化合物提取的最優(yōu)工藝條件 根據(jù)表1的正交試驗因素水平，對黃酮類化合物的提取條件進(jìn)行正交設(shè)計，見表4。各因子對提取率的影響依次為：提取溫度、提取料液比、提取劑體積分?jǐn)?shù)和提取時間，最優(yōu)工藝條件為：A2B1C2D3，即體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇、料液比1∶20、提取時間3 h和溫度75℃。

圖2 不同提取時間、料液比及溫度對四季桂花瓣黃酮類化合物的提取效果Figure 2 Effect of different extracting time，material-solvent ratios，and temperatures to extract petal flavonoids of Osmanthus fragrans‘Siji Gui’

2.4 四季桂花瓣類胡蘿卜的提取方法

2.4.1 提取劑、提取時間、溫度與料液比等單因素試驗 由圖3可以看出，石油醚與丙酮 ∶乙醇（1∶1）溶液提取的四季桂花瓣提取液在443，472和502 nm下的吸光度都很高。但由于石油醚溶液作提取劑時，四季桂花瓣粉末粘于試管壁，所以宜采用丙酮∶乙醇（1∶1）溶劑作為提取劑。提取時間為2.5和3.5 h時出現(xiàn)了波峰，但時間過長會引起溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致提取物濃度的升高，因此提取時間為2.5 h較好。在料液比為1∶20時，有明顯的吸收峰。在提取溫度為45，60℃時均有吸收峰，但由于丙酮的沸點為56.5℃，乙醇的沸點為78.5℃，溫度為45.0℃時提取效果較好。

2.4.2 類胡蘿卜素提取的最優(yōu)工藝條件 根據(jù)表2對類胡蘿卜素的提取條件進(jìn)行正交試驗設(shè)計（表5）。由此可知，在不同的吸光度下，各因素對提取率的影響由大到小依次為：料液比、提取溫度和提取時間。其最佳工藝條件都為E3F1G3，即提取時間3 h，料液比1∶10，溫度50℃。

表3 四季桂花瓣不同提取劑各濃度下浸提液的吸光度（λ=320 nm）Table 3 Osmanthus fragrans‘Siji Gui’petal pigment absorbances of extraction solvents and different concentrations（λ=320 nm）

表4 四季桂花瓣黃酮類化合物提取的正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of extracting petal flavonoids of O.fragrans‘Siji Gui’

3 討論

黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇等溶劑，難溶于水，且在低濃度的甲醇中，其溶解性較好，所以甲醇一直被廣泛用于天然黃酮類化合物的提?。?4］。但在玫瑰 Rosa rugosa 花瓣［15］的黃酮類色素提取工藝研究中發(fā)現(xiàn)，乙醇作為提取劑時，提取效果也很好，甚至超過甲醇；近幾年在提取八仙花Hydrangea macrophylla花瓣黃酮類化合物時，也有用乙醇作為提取劑［16］。鑒于甲醇的毒性，黃酮類化合物的提取純化產(chǎn)物多用于醫(yī)藥和食品，因此在本次試驗中選取體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇為四季桂花瓣中黃酮類化合物提取的最佳試劑。選取1∶20的料液比在45.0℃的條件下浸提3 h時的效果最佳。本實驗所得的最佳提取條件與前人在桂花總黃酮含量測定試驗［17］中所得的結(jié)果略有差異，可能是由于選取的實驗材料及實驗環(huán)境不同。在對四季桂花瓣類胡蘿卜素的提取試驗中雖然發(fā)現(xiàn)用石油醚和丙酮 ∶乙醇（1∶1）作為溶劑提取效果都很好，但使用石油醚時，花瓣粉末易粘于試管壁，增加了純化回收的難度［7］，因此本試驗選用丙酮 ∶乙醇（1∶1）溶液作為提取劑，以1∶10的料液比在50.0℃的條件下浸提3 h獲得最佳的提取效果。而本研究只選取了葉黃素、番茄紅素和胡蘿卜素作為類胡蘿卜素的代表進(jìn)行分析，結(jié)果可能會有一定的局限性。而且黃酮類化合物和類胡蘿卜素的種類都十分豐富，因此在科研或生產(chǎn)中可根據(jù)實際情況對最佳提取條件進(jìn)行選擇。下一步的工作是進(jìn)一步分離純化或采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等儀器確定色素物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從次生代謝產(chǎn)物水平分析不同桂花品種花色的差異與機理，也作為桂花花色育種工作的參考。

圖3 不同提取溶劑、提取時間、料液比及溫度對四季桂花瓣類胡蘿卜素的提取效果Figure 3 Effect of different solvent types，time，material-solvent ratios and temperature to extract petal carotenoids of Osmanthus fragrans‘Siji Gui’

表5 四季桂花瓣類胡蘿卜素提取的正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test result of extracting petal carotenoids of Osmanthus fragrans‘Siji Gui’

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