影響文心蘭葉片體胚誘導(dǎo)的條件研究

潘鑾銀，宋紅改，蔣 晶，喬桂榮，李海營，王 揚，林永生，卓仁英

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽311400；3.三峽大學(xué) 生物技術(shù)研究中心/天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；4.福建省莆田市江口農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，福建 莆田 351115）

文心蘭 Oncidium flexuosum，又名舞女蘭、瘤瓣蘭，為蘭科 Orchidaceae瘤瓣蘭屬 Oncidium植物，原產(chǎn)美國、墨西哥、圭亞那和秘魯。文心蘭具圓錐花序，花黃色，花莖輕盈下垂，花朵奇異可愛，形似飛翔的金蝶，極富動感，是世界重要的盆花和切花種類之一［1－2］。文心蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)已比較成熟。通過外植體誘導(dǎo)類原球莖（protocorm-like bodies，PLBs）及叢生芽并快速增殖可獲得大量幼苗［3］。文心蘭無菌苗的根尖、葉表面、葉切口和莖的切口在離體培養(yǎng)時會生成透明狀的組織塊，然后長成黃白色的的愈合組織，或直接長出愈合組織，愈合組織發(fā)育成體胚，再形成圓球狀的類原球莖，通過控制培養(yǎng)條件，在文心蘭外植體傷口上可不經(jīng)愈合組織而直接形成體胚［4－6］。文心蘭‘南茜’Oncidium flexuosum‘Gower Ramsey’離體葉片在添加噻苯?。╰hidiazuron，TDZ）的改良 1/2 MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出直接體胚，這些體胚能形成類原球莖，進而發(fā)育成正常的植株［4，7］。培養(yǎng)基的成分和植物生長調(diào)節(jié)劑以及品種差異對文心蘭離體葉片誘導(dǎo)體胚有很大影響［8－9］，離體葉片的葉尖、葉面、葉背、葉緣和葉切口均能形成體胚，最易形成體胚的部位是葉尖［7］，葉尖和葉切口的體胚誘導(dǎo)率分別達到57.5%和30.0%［10］。文心蘭無論屬內(nèi)雜交還是屬間雜交，其親和力都較差、授粉結(jié)實機率低，通過雜交培育新品種難度大、周期長［11］。日漸成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為蘭花育種開辟了新途徑。使用根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumetaciens介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法可將DOHI與DOMADSI的反義基因轉(zhuǎn)入到蘭花中［12］，Liau等［13］嘗試了以文心蘭原球莖為受體利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因，但迄今未見通過轉(zhuǎn)基因獲得蘭花新品種的成功報道。對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功的事例的統(tǒng)計結(jié)果表明，以葉片位外植體進行轉(zhuǎn)化的成功率遠(yuǎn)高于其他外植體類型，同時體胚轉(zhuǎn)基因成功的例子也日益增多［14－15］。文心蘭離體葉片的切口能形成體胚并容易獲得再生植株，可以作為根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料，因此，建立高效穩(wěn)定的葉片體胚再生體系是蘭花轉(zhuǎn)基因育種的重要環(huán)節(jié)。本文報告了文心蘭‘百萬金幣’Oncidium flexuosum‘Million Dollar’離體葉片葉位、葉片大?。ㄈ~齡）、不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合處理對葉片切口體胚誘導(dǎo)的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

文心蘭‘百萬金幣’類原球莖（無菌組培材料）轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基［MS基本培養(yǎng)基添加磷酸二氫鈉170.00 mg·L－1，吲哚丁酸（IBA）1.00 mg·L－1，谷胺酰胺 500.00 mg·L－1，活性碳 1 000.00 mg·L－1，蔗糖 30 000.00 mg·L－1，瓊脂 7 000.00 mg·L－1］，pH 5.5，培養(yǎng)溫度為 24～26 ℃，光照時間 16 h·d－1，光照強度為1 200～1 600 lx。60 d換1次培養(yǎng)基，選取不同大小的幼苗葉片供實驗用。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基［14］（其中微量元素和有機添加物為全量，鐵鹽減半），其他添加物為磷酸二氫鈉 170.00 mg·L－1，谷胺酰胺 1 000.00 mg·L－1，蛋白胨 1 000.00 mg·L－1，噻苯?。═DZ）0.50 mg·L－1，聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）250.00 mg·L－1，蔗糖 20 000.00 mg·L－1，固化劑（gelrite）2 800.00 mg·L－1，pH 5.2，121℃滅菌15 min。培養(yǎng)容器為直徑90 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)溫度24～26℃，暗培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 葉片處理 根據(jù)實驗要求選取幼苗，將葉片從基部剪下，再在葉片中間剪一長度約為2/3葉寬的口子，近軸面朝上置于培養(yǎng)基上，放入葉片8片·皿－1，暗培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計長出體胚的葉片數(shù)和體胚發(fā)生部位。10個（10皿）重復(fù)·處理－1。

1.3.2 幼苗帶根對體胚誘導(dǎo)的影響 分別選取15～35 mm長帶根和無根幼苗，剪取10～30 mm長的葉片進行體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.3 葉位對體胚誘導(dǎo)的影響 選取葉片長度為15～30 mm的帶根幼苗，以近莖頂端的葉為第1葉，分別剪取第1葉和第2葉進行體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.4 葉片長度對體胚誘導(dǎo)的影響 分別選取5～10，10～30，15～25，30～50，50～70 mm長的葉片分組進行體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.5 植物生長調(diào)節(jié)劑對體胚誘導(dǎo)的影響 共設(shè)以下9個處理：噻苯?。═DZ）（0.10，0.25，0.50，1.00，2.00 mg·L－1），6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）（1.00，3.00 mg·L－1），細(xì)胞激動素（KT）（1.00，3.00 mg·L－1），選取 10～30 mm長的葉片進行體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 葉片體胚總誘導(dǎo)率＝形成體胚（任何位置）的葉片數(shù)/接種葉片總數(shù)；葉片部位（葉基部切口、葉中切口、葉尖、葉面和葉緣）體胚誘導(dǎo)率＝部位形成體胚的葉片數(shù)/接種葉片總數(shù)。數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析采用SAS 9.13。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗帶根對誘導(dǎo)體胚的影響

從圖1中數(shù)據(jù)可看出，無根苗的體胚總誘導(dǎo)率僅為25.36%，而有根苗則高達90.27%以上，無根苗葉尖、葉面、葉緣、葉基部切口、葉中切口的體胚誘導(dǎo)率分別為20.48%，0，0，4.71%和0.64%，帶根健壯苗的相對應(yīng)部位體胚誘導(dǎo)率分別為71.62%，36.82%，48.60%，74.56%和66.91%，2種類型的葉片體胚總誘導(dǎo)率在差異3.5倍以上（圖1），可見，完整的健壯的帶根幼苗是誘導(dǎo)體胚的適宜材料。帶根幼苗葉基部切口和中切口體胚誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于無根幼苗葉片，這一點對于建立離體葉片體胚再生體系具有重要價值。

圖1 不同植株類型葉片對文心蘭體胚誘導(dǎo)的影響Figure 1 Effects of leaf of free-rooted breeding and breeding with root on somatic embryogenesis from Oncidium flexuosum‘Million Dollar’

2.2 葉位對體胚誘導(dǎo)的影響

本實驗所選用的幼苗大多具2～4片葉，由于第3葉第4葉片偏小，不適宜本實驗，所以僅選用第1葉第2葉。圖2中的數(shù)據(jù)表明第1葉和第2葉體胚總誘導(dǎo)率基本接近，分別為64.24%和68.19%，葉片各部位產(chǎn)生的體胚比率差異也不大，葉尖、葉面、葉緣、葉基部切口、葉中口第1葉第2葉分別為41.83%，16.90%，16.90%，33.65%，32.41%和 43.04%，15.33%，12.87%，8.86%，36.07%，葉基部切口和葉中切口體胚誘導(dǎo)率也保持在較高水平（圖2），其原因可能是在試管培養(yǎng)條件下，文心蘭原球莖分化形成芽時，第1葉和第2葉形成的時間很接近，葉基的位置也相近，葉片大小相差不多，其生理特性也比較接近。

圖2 不同葉片位置對文心蘭體胚誘導(dǎo)的影響Figure 2 Effects of leaf position on somatic embryogenesis from Oncidium flexuosum‘Million Dollar’

2.3 葉片長度（葉齡）對體胚誘導(dǎo)的影響

文心蘭試管苗中的幼葉處于最初的生長階段，其葉片的長短，與生長時間呈正相關(guān)，可以認(rèn)為，葉片的長短代表了葉齡。實驗表明葉片長度對體胚誘導(dǎo)率有顯著影響（圖3），小于1 cm長的葉片體胚誘導(dǎo)率較低，其總誘導(dǎo)率僅為19.42%，體胚發(fā)生位置主要在葉尖和葉基切口，葉中切口、葉面和葉緣很少有體胚發(fā)生（低于1%）。隨著葉片長度（葉齡）的逐漸增加，無論是葉尖、葉面和葉緣部位，還是切口部位體胚誘導(dǎo)率迅速增加。葉片長度10～30 mm時，體胚總誘導(dǎo)率迅速增加至61.00%，葉基切口、葉中切口、葉尖的體胚誘導(dǎo)率分別增加為33.29%，23.07%和44.83%。當(dāng)葉片長度為15～25 mm時，呈現(xiàn)體胚誘導(dǎo)率的高峰，體胚總誘導(dǎo)率達84.20%，葉基切口體胚總誘導(dǎo)率達41.99%，葉中切口體胚誘導(dǎo)率達25.36%，葉尖體胚誘導(dǎo)率達60.51%。當(dāng)葉片長度超過30 mm時，體胚誘導(dǎo)率迅速下降，葉片為30～50 mm時的體胚總誘導(dǎo)率僅為8.28%；而當(dāng)葉片長度為50～70 mm時，葉片體胚誘導(dǎo)率僅為1.72%。實驗結(jié)果表明，選擇適宜的葉片長度（葉齡），對于維持較高的體胚誘導(dǎo)率至關(guān)重要，如果要從葉基部切口和葉中切口獲得較多有效體胚，從20～25 mm長的帶根幼苗剪取15～20 mm長的葉片是最適外植體。

圖3 不同葉片長度對文心蘭體胚誘導(dǎo)的影響Figure 3 Effects of leaf length on somatic embryogenesis from Oncidium flexuosum‘Million Dollar’

2.4 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對體胚誘導(dǎo)的影響

細(xì)胞激動素（KT）是影響文心蘭葉片體胚誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素［8，16］，噻苯隆、6-BA和KT均具有強烈促進細(xì)胞分裂的作用，對文心蘭幼葉體胚誘導(dǎo)具有強烈的促進效果（圖4）。噻苯隆質(zhì)量濃度為0.25 mg·L－1和0.50 mg·L－1，時，葉片的總誘導(dǎo)率分別為66.90%和65.96%，隨著噻苯隆的質(zhì)量濃度增加至1.00 mg·L－1或2.00 mg·L－1，體胚總誘導(dǎo)率開始下降，分別為58.09%和39.69%。6-BA質(zhì)量濃度為 1.00 mg·L－1和3.00 mg·L－1時，文心蘭葉片總誘導(dǎo)率均在40.00%以上，比添加噻苯隆的誘導(dǎo)效果要差。KT質(zhì)量濃度為 1.00 mg·L－1和 3.00 mg·L－1時，文心蘭葉片體胚總誘導(dǎo)率分別為 34.72%和 25.40%，約為添加噻苯隆處理的一半，比添加6-BA的效果要差。在大多數(shù)激素處理條件下，葉尖體胚發(fā)生的頻率明顯高于其他部位。噻苯隆質(zhì)量濃度在0.25～1.00 mg·L－1范圍時，葉尖體胚的誘導(dǎo)率達40.00%以上，葉基切口體胚誘導(dǎo)率為30.00%～45.00%，葉中切口體胚誘導(dǎo)率為13.00%～23.00%，葉片切口總誘導(dǎo)率超過了葉尖體胚誘導(dǎo)率。實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)噻苯隆質(zhì)量濃度為0.50 mg·L－1時，葉片切口的總誘導(dǎo)率達68.75%，遠(yuǎn)超過葉尖體胚誘導(dǎo)率43.61%。而本實驗的目標(biāo)是盡可能多地從葉片基部切口和葉中切口誘導(dǎo)形成體胚，因此在培養(yǎng)基中添加0.50 mg·L－1噻苯隆是比較合適的選擇。

圖4 不同激素組合對文心蘭葉片體胚誘導(dǎo)的影響Figure 4 Effects of plant growth regulators on somatic embryogenesis from Oncidium flexuosum‘Million Dollar’

3 討論

Chen 等［5，6，9－10］和 Su 等［8］的報道和本研究的大量實驗都表明，采用目前的培養(yǎng)體系，文心蘭葉片的葉尖、葉面、葉緣、葉中切口和葉基部切口均能形成體胚，這些體胚能迅速增殖并形成原球莖，與其他外植體獲得的原球莖沒有差異，最終能成為正常植株。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對于文心蘭離體葉片體胚誘導(dǎo)起著重要作用。Chen等［16］使用生長素類（2，4-D，吲哚乙酸IAA，吲哚丁酸IBA，萘乙酸NAA）和細(xì)胞激動素類（異戊烯基腺嘌呤2iP，6-芐氨基腺嘌呤6-BA，細(xì)胞激動素KT，噻苯隆TDZ，玉米素ZT）誘導(dǎo)文心蘭離體葉片形成體胚，發(fā)現(xiàn)生長素類不能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，而細(xì)胞激動素類均能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，其中噻苯隆和KT的質(zhì)量濃度為3.00 mg·L－1時效果較好。在本實驗中，噻苯隆誘導(dǎo)體胚的效果好于6-BA和KT，且最適質(zhì)量濃度也較低，可能是由于供試文心蘭品種的不同及對葉片長度（葉齡）限定的原因。離體葉片體胚發(fā)生率最高的部位是葉尖［7］，這可能與葉尖細(xì)胞的生理特性有關(guān)。由于提高葉片切口有效體胚的誘導(dǎo)率對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因具有重要意義，通過選擇適宜的外植體材料、培養(yǎng)基配方、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合和質(zhì)量濃度以及合適的培養(yǎng)條件，能較大幅度提高文心蘭葉片切口體胚的誘導(dǎo)率，同時適度增加傷口的面積也是增加切口體胚誘導(dǎo)率的一個途徑。本實驗嘗試在文心蘭葉片上增加一個中切口，取得了較好的效果，中切口體胚誘導(dǎo)率可達20.00%以上，近次于葉尖和葉基部切口。但增加切口加重葉片的受傷程度，要控制在一定程度，否則反而會降低體胚誘導(dǎo)率。本實驗所采用的葉片材料均來自文心蘭類原球莖發(fā)育、芽分化、生長而形成的幼苗，供試幼苗帶2～4片葉，第1葉和第2葉的葉柄位置緊靠著，葉芽的萌發(fā)時間相近，葉片尺寸差異不大，性狀相似，誘導(dǎo)體胚的效果也非常接近。Chen 等［4］在 1/2 MS 培養(yǎng)基中添加噻苯隆 1.00 mg·L－1和 3.00 mg·L－1，文心蘭南茜葉片長度為50～70 mm時，其體胚誘導(dǎo)率分別為10.00%～35.00%，而同樣條件下20～40 mm長葉片體胚誘導(dǎo)率為分別為15.00%～25.00%，20～70 mm范圍內(nèi)葉片體胚誘導(dǎo)率變化不大。在相似的條件下，文心蘭‘百萬金幣’葉片長度對體胚誘導(dǎo)率的影響非常大，15～25 mm長葉片體胚誘導(dǎo)率達80.00%，大于30 mm長的葉片體胚誘導(dǎo)率迅速下降至10.00%以下。除了培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等影響因素外，文心蘭不同栽培品種和不同類型的生物學(xué)特性差異可能也是不同長度葉片（不同年齡）體胚誘導(dǎo)率較大差異的主要原因。就一般規(guī)律而言，文心蘭離體葉片的特性和狀態(tài)對體胚誘導(dǎo)率的影響是比較大的［8］。針對不同品種的文心蘭，需要通過具體實驗比較才能獲得較高的體胚誘導(dǎo)率。

此外，文心蘭葉片的褐化尤其是從葉片的切口處出現(xiàn)的褐化是嚴(yán)重影響體胚誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素之一。褐化通常是在葉片離體培養(yǎng)10 d左右在基部切口和葉片中切口邊緣出現(xiàn)，顏色由淡褐色逐漸加深至深褐色或黑色，葉片一旦出現(xiàn)褐化，基本上無法誘導(dǎo)形成體胚。文心蘭離體葉片培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的褐化與文心蘭組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象相類似［8］，是由植物細(xì)胞中酚類化合物被氧化產(chǎn)生褐色的酚醌類化合物。本實驗在培養(yǎng)基中添加250.00 mg·L－1PVPP，降低培養(yǎng)基中鐵離子的濃度，對減少文心蘭離體葉片的褐化率和減輕褐化程度有較好效果。

致謝：感謝中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所歐陽彤副研究員提供文心蘭‘百萬金幣’無菌試管苗實驗材料。潘鑾銀、蔣晶、宋紅改等對本文貢獻相同，為并列第一作者。

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