熒光原位雜交技術(shù)在檢測(cè)人精子染色體異常中的應(yīng)用進(jìn)展

黃 梅 綜述，石 紅 審校

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011)

目前精子染色體檢測(cè)主要有3種方法：人精子與金黃地鼠卵體外受精法(the hamster egg-human sperm fusion techinque),熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和引物介導(dǎo)的熒光原位雜交法(PRINS)?？偨Y(jié)近10年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)精子染色體的研究，F(xiàn)ISH以其能夠快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度及高特異性檢測(cè)精子中期和間期細(xì)胞核，一次檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)精子染色體而被廣泛應(yīng)用。FISH技術(shù)已用于檢測(cè)正常人、不育者、染色體平衡易位攜帶者及腫瘤患者在化療前后精子染色體非整倍體率的改變，還可用于環(huán)境致突變的研究。同時(shí)，F(xiàn)ISH技術(shù)也由起初的單色發(fā)展為如今的雙色、多色FISH。

多色FISH是在原來(lái)單色FISH分析的基礎(chǔ)上對(duì)研究精子染色體非整倍體的很好補(bǔ)充。這種方法的優(yōu)點(diǎn)：①可以同時(shí)檢測(cè)多條染色體；②可根據(jù)染色體數(shù)目異常確定是否為多倍體或非整倍體；③區(qū)別減數(shù)分裂I(MI)不分離與減數(shù)分裂II(MII)不分離。因此，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)者采取多色FISH方法分析。

1 精子染色體非整倍體的發(fā)生

精子染色體的非整倍體的發(fā)生是由染色體數(shù)目異常的生殖細(xì)胞引起的，起源于減數(shù)分裂過程中的染色體分離異常、減數(shù)分裂受阻和染色體不分離產(chǎn)生多倍體精子。

2 FISH在正常人精子中非整倍體分析中的應(yīng)用

染色體數(shù)目異常者的父母往往是正常的，表明正常人能產(chǎn)生非整倍體的生殖細(xì)胞。迄今為止，除了5、13、14、19號(hào)染色體以外的二倍體率均有報(bào)道。Martin等[1]的研究顯示，性染色體和21號(hào)染色體較其他常染色體二體率有明顯的升高。精子中各對(duì)常染色體不分離導(dǎo)致的二體率大多介于0.10%～0.20%，而性染色體二體的發(fā)生率為0.20%～0.40%，二倍體率為0.10%～0.20%，F(xiàn)ISH與精卵融合技術(shù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果吻合。

3 FISH在不育男性精子非整倍體分析中的應(yīng)用

男性不育癥病因包括：少精子癥、弱精子癥、畸精子癥及抗精子抗體所致的免疫性不育等。其中少、弱、畸精子癥病人較為多見，其染色體異常與不明原因反復(fù)流產(chǎn)或死胎、不育之間有相關(guān)性[2]。

開展精子FISH研究主要針對(duì)不育癥人群，鑒于性染色體與不育癥的遺傳關(guān)系，即性染色體對(duì)伴性遺傳的提示作用，幾乎所有的研究都包括性染色體非整倍體率的測(cè)定。常染色體的非整倍體研究也具有重要的指導(dǎo)意義。目前，研究較多的常染色體為1、7、13、18、21，其中尤以18和21號(hào)染色體研究居多[3-6]，而國(guó)內(nèi)更多是采用性染色體與18號(hào)染色體的多色FISH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.1 弱、畸精癥與精子染色體非整倍體率

有研究發(fā)現(xiàn)，精子質(zhì)量差的不育男性患者精液中精子非整倍體率有上升趨勢(shì)，即使是形態(tài)正常的精子也有較高的精子非整倍體率[7]，而畸精癥患者(WHO1992年標(biāo)準(zhǔn)1%～13%的正常形態(tài))的精子這種趨勢(shì)更加明顯。Templado等[8]研究根據(jù)FISH的測(cè)定信號(hào)，在畸精癥患者精子中(13，13)，XX，YY的精子率均較正常對(duì)照組明顯升高。Harkonen等[9]的研究也支持這個(gè)觀點(diǎn)。在其研究中，還發(fā)現(xiàn)7號(hào)和18號(hào)染色體也有較高的二體率。Devillard等[10]應(yīng)用雙色和三色FISH檢測(cè)了巨頭或大頭多尾的精子，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的精子存在X和Y染色體的至少一個(gè)拷貝，多于一半的精子具有1或18的至少兩個(gè)拷貝。Lewis-Jones等[11]研究了3個(gè)嚴(yán)重少畸精癥或全畸精癥不育男性的精子，發(fā)現(xiàn)雙頭、多核頭和多尾精子的發(fā)生率很高，用18號(hào)染色體和性染色體探針分析，18號(hào)染色體和性染色體的二體、三體、四體率分別是100%、76%和82.5%。

3.2 少、無(wú)精癥患者精子的非整倍體率

近年隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)已被廣泛用于治療少精、無(wú)精癥的不育患者，但該技術(shù)避開了卵子對(duì)精子的自然選擇，容易把異常的精子特別是染色體異常精子注射入卵子內(nèi)，增加了將遺傳異常傳遞給后代的危險(xiǎn)性。因此，需要對(duì)患者進(jìn)行精子FISH的研究和胚胎種植前遺傳學(xué)診斷(PGD)，篩查非整倍體，以便對(duì)需要行ICSI的夫婦進(jìn)行遺傳學(xué)咨詢。

國(guó)內(nèi)外研究顯示，少精患者的精子非整倍體率較高。王喜良等[12]采用18、X、Y染色體探針對(duì)嚴(yán)重少精癥患者精液中精子的非整倍體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重少精子癥患者精子18、性染色體二體率和二倍體率同正常對(duì)照組比較差異有顯著性意義。

男子無(wú)精癥可被分為梗阻性和非梗阻性無(wú)精癥兩種。前者睪丸生精功能正常，因輸精管阻塞使產(chǎn)生的精子無(wú)法排出體外；后者是因?yàn)椴G丸本身生精功能障礙而不能或只產(chǎn)生極少的精子，精液中查不到精子。其中非阻塞性無(wú)精癥患者想達(dá)到自體精子受精，需要睪丸取精行ICSI，但由于睪丸取精的不成熟性，其染色體的非整倍體率也較高。

Palermo CTD[13]對(duì)18、21、X、Y染色體FISH研究的統(tǒng)計(jì)表明，睪丸取精的精子總的非整倍體率高達(dá)11.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于附睪取精(1.8%)和射精(1.5%)，其中以性染色體的非整倍體率最常見。阻塞性無(wú)精癥則需附睪取精行輔助生育治療，而附睪精子和射出精子的非整倍體率差異無(wú)顯著性意義。在非阻塞性和阻塞性無(wú)精癥中，最常見的非整倍體形式為性染色體的二體，而在射出精子最常見的是常染色體二體。Martin等[14]的研究也證實(shí)上述觀點(diǎn)。

4 FISH在檢測(cè)平衡易位攜帶者精子染色體非整倍體的應(yīng)用

染色體平衡易位是染色體結(jié)構(gòu)異常的常見形式之一，雖然染色體平衡易位攜帶者的一般表型及智力正常，但其精子在減數(shù)分裂中會(huì)產(chǎn)生染色體非平衡配子，與卵子結(jié)合后形成的胚胎可能因發(fā)育異常形成畸形胎兒，甚或流產(chǎn)。曾勇等[15]應(yīng)用三色FISH通過探討外周血染色體平衡易位患者在精子發(fā)生過程中染色體分離模式，預(yù)測(cè)攜帶者在胚胎移植前PGD中得到正常表型胚胎的概率,為PGD的應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

羅伯遜易位是平衡易位的一種特殊形式，目前對(duì)此方面研究的較多。Rives等[16]對(duì)t(13；15)患者精子染色體分析，其非整倍體率異常配子發(fā)生率為18.01%。Ogur等[17]對(duì)精子染色體分析中發(fā)現(xiàn)，羅伯遜易位染色體間存在染色體間效應(yīng)，即除參與易位的染色體外，其他染色體非整倍體率也可能受到影響。

5 FISH在有毒物接觸史及睪丸癌化療后精子非整倍體分析中的應(yīng)用

有研究發(fā)現(xiàn)，接觸苯類、二氧化硫、氰化物等物質(zhì)工人的精子染色體非整倍體率較正常對(duì)照組顯著升高。Xu等[18]分析30例丙烯腈暴露男性精子染色體非整倍體率，暴露組性染色體二體率為0.69%，對(duì)照組為0.35%，差異顯著；XY二體是暴露組中最常見形式。

De Mas等[19]采用FISH方法研究睪丸癌患者PEB化療后6～18個(gè)月精子細(xì)胞非整倍體，使用7、16、18、X、Y染色體探針。結(jié)果表明，精子的二倍體率和16、18二體，XY精子顯著增加，推測(cè)精子生成回復(fù)階段的精子非整倍體可能是PEB療法的副作用，建議患者在化療期間避孕，化療結(jié)束妊娠亦應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢和監(jiān)測(cè)。

FISH技術(shù)用于研究精子染色體結(jié)構(gòu)，方法簡(jiǎn)單，適合對(duì)大量人精子進(jìn)行非整倍體的研究。男性不育與精子染色體異常存在潛在相關(guān)性，對(duì)精液異常的男性不育患者治療前進(jìn)行非整倍體分析，有助于優(yōu)生和遺傳咨詢。

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