痰熱清注射液對膿毒癥大鼠免疫調(diào)節(jié)及生存率的影響

趙中江 孫冀武 鄧 哲

廣東省深圳市第二人民醫(yī)院（深圳 518035）

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素原(PCT）作為次級炎癥因子，其升高水平與膿毒癥嚴重程度有關(guān)[1]。腫瘤壞死因子－α(TNF－α）作為主要的致炎細胞因子，在引起機體失控性炎癥反應(yīng)與組織損害中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。實驗與臨床研究顯示，痰熱清注射液具有調(diào)節(jié)免疫，減輕炎癥反應(yīng)的作用[3,4]。本研究旨在觀察痰熱清注射液對膿毒癥大鼠PCT、TNF－α水平及生存率的影響，探討痰熱清注射液對膿毒癥的治療作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 清潔級Wistar大鼠，體重220～250g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP）復(fù)制Wistar大鼠腸源性膿毒癥模型。大鼠實驗前禁食12h，自由飲水，術(shù)前稱體重，氯胺酮(100mg/kg）腹腔麻醉后固定，鋪無菌孔巾，沿中下腹正中線切口2cm，暴露腹腔臟器，將盲腸提出，在距盲腸根部1cm血管弓處用7號絲線結(jié)扎盲腸，避免腸梗阻和腸壞死。用18號無菌針頭貫穿盲腸3次，使腸內(nèi)容物流出，避免傷及腸壁系膜血管，然后將盲腸放回腹腔，逐層縫合腹部切口。術(shù)畢動物皮下注射生理鹽水10mL/kg抗休克，術(shù)后自由飲水。假手術(shù)組僅開腹翻動盲腸后關(guān)腹。

1.2 動物分組及給藥 將112只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組(n=8）、假手術(shù)組(n=8）、模型組(n=48）及痰熱清治療組(n=48），模型組和痰熱清治療組又分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ6個亞組，每組8只大鼠。Ⅰ組大鼠觀察CLP術(shù)后7d的生存率。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 5 個亞組分別為 CLP 術(shù)后 2、6、12、24、48h組。痰熱清治療組分別于CLP術(shù)后0.5、12h及其后每隔12h靜注痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），劑量0.45mL/100g，模型組依同法分組并平行注射等量生理鹽水作為對照。

1.3 標本采集及檢測 各時間點心臟直接取血4mL，加入乙二胺四乙酸抗凝管中4℃下3000r/min離心15min后，取上清液－70℃保存。用ELISA法檢測PCT和TNF－α的水平，試劑盒購于深圳精美生物工程有限公司。操作方法嚴格按試劑盒所附說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以(）表示，采用方差分析及χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠7d生存率的比較 模型組、痰熱清治療組的7d生存率分別為0和62.5%。痰熱清治療組的生存率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。

2.2 各組膿毒癥大鼠血漿PCT水平比較 見表1。與正常對照組比較，假手術(shù)組血漿PCT水平無明顯變化（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組PCT水平在CLP后6h即明顯升高，12h達到高峰，除2h時點外，各時點與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01）；與模型組比較，痰熱清治療組PCT水平在6、12、24及48h 4個時點明顯降低（P ＜0.01）。

表1 各組膿毒癥大鼠血漿PCT水平比較（ng/mL，）

表1 各組膿毒癥大鼠血漿PCT水平比較（ng/mL，）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.01。下同

組 別正常對照組假手術(shù)組模型組痰熱清治療組2h 6h 24h 48h 0 0 0 0 0 0 0 0 0.23±0.08 0.24±0.07 3.52±0.42*2.67±0.34△12h 0.24±0.09 0.23±0.10 6.85±0.91*4.53±0.82△4.63±0.57*3.28±0.48△3.68±0.64*2.91±0.45△

2.3 各組膿毒癥大鼠血漿TNF－α水平比較 見表2。與正常對照組比較，假手術(shù)組血漿TNF－α水平無明顯變化（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組TNF－α水平在CLP后6h明顯升高，12h達到高峰，除2h時點外，各時點與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）；與模型組比較，除2h時點外，痰熱清治療組TNF－α水平在各時點均明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組膿毒癥大鼠血漿TNF－α水平比較（ng/mL，）

表2 各組膿毒癥大鼠血漿TNF－α水平比較（ng/mL，）

組 別正常對照組假手術(shù)組模型組痰熱清治療組2h 6h 24h 48h 0 0 0 0 0 0 0 0 6.64±1.16 6.36±1.92 22.80±2.14*14.92±2.01△12h 6.24±1.63 6.51±1.29 38.16±3.73*24.19±3.25△26.70±5.61*20.05±5.94△18.61±6.85*14.86±4.37△

3 討論

本實驗采用經(jīng)典CLP方法復(fù)制Wistar大鼠膿毒癥模型。CLP模型模擬臨床急性腸穿孔和腹膜炎的發(fā)病過程，能很好地反映膿毒癥的病理生理變化，應(yīng)用此模型進行的研究更具說服力。

PCT是一種由116種氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。在正常代謝情況下，甲狀腺C細胞內(nèi)的PCT經(jīng)蛋白水解后產(chǎn)生和分泌降鈣素。正常個體的PCT值 ＜0.5ng/mL，試驗條件下PCT的主要誘導(dǎo)源是細菌內(nèi)毒素——脂質(zhì)多糖(LPS）。LPS和其他多種炎癥因子誘導(dǎo)PCT的產(chǎn)生，其升高程度不僅可反映引起炎癥的病原體濃度還顯示炎癥反應(yīng)程度。與其他細胞因子相比，LPS短時間內(nèi)可誘導(dǎo)大量PCT生成，提示LPS可能直接促進PCT mRNA的表達和蛋白翻譯[5]。在健康志愿者靜脈注射一定量內(nèi)毒素后3～4h PCT水平迅速升高，6～8h達平臺期并持續(xù)24h以上[6]。PCT濃度的升高不受機體免疫抑制狀態(tài)的影響。當(dāng)機體處于嚴重的細菌感染或膿毒血癥時，即使患者處于免疫抑制狀態(tài)或尚無明顯的臨床表現(xiàn)，血漿中PCT濃度仍明顯升高，其升高程度與感染嚴重程度呈正相關(guān)[6]。

動物實驗提示PCT可能是一種次級炎性因子，它本身不能啟動膿毒癥反應(yīng)，但可放大并加重膿毒癥病理過程[1]。Reith及Brunkhorst等[7,8]的研究顯示，膿毒癥組患者的PCT值明顯高于非膿毒癥組，其升高水平與膿毒癥的嚴重程度有關(guān)。此外PCT用于診斷膿毒癥有較好的敏感性、特異性和準確性。與正常對照組比較，我們發(fā)現(xiàn)PCT在CLP后6h即明顯升高，12h達到高峰，并持續(xù)至48h，且質(zhì)量濃度均大于2ng/mL。

研究者曾對膿毒癥的另外一些標志如WBC、白介素6、TNF－α、C反應(yīng)蛋白、可溶性CD14與PCT進行系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)血清PCT是敏感性、特異性最佳的指標，最能及時反映炎癥、膿毒癥過程。一般情況下，膿毒癥PCT均升高且＞2ng/mL[9]。研究顯示粒細胞減少癥者PCT＞0.5ng/mL則提示合并細菌感染，全身真菌感染包括念珠菌和曲霉菌也引起PCT顯著增加[10]。通常PCT＞5ng/mL提示重癥感染，包括免疫抑制患者如艾滋患者，高濃度的PCT、特別是抗生素治療后無下降者常提示預(yù)后不良[11]。Luzzani等[12]觀察術(shù)后重癥感染患者顯示，C反應(yīng)蛋白在所有病例治療后均保持高水平，但PCT濃度在存活者中迅速下降，在死亡病例中處于高水平。PCT濃度變化可用來判斷膿毒癥和菌血癥者抗生素治療是否有效和臨床情況是否改善。

TNF－α是參與多種生理與免疫過程的重要細胞因子，具有廣泛的生物活性，目前認為其是參與全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥等的重要炎癥介質(zhì)。膿毒癥時，血清TNF－α水平升高，可反映感染的嚴重程度，與預(yù)后有較好的相關(guān)性[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，血清TNF－α水平在CLP后6h即有明顯升高。

既然PCT及TNF－α在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其升高的水平與膿毒癥的嚴重程度及預(yù)后密切相關(guān)。降低PCT及TNF－α的水平，能有效改善膿毒癥患者的預(yù)后。運用中藥制劑對膿毒癥進行免疫干預(yù)是一個研究方向。

痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹組成。文獻報道，痰熱清對感染等所致急性肺損傷、肺泡炎性滲出和微血管損傷的低氧血癥等病理狀態(tài)有明顯的改善作用，可減少多器官功能障礙等并發(fā)癥的發(fā)生[3]，同時具有調(diào)節(jié)免疫的作用，可降低TNF－α、IL－6水平，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，減輕炎性介質(zhì)所致的炎癥反應(yīng)，減少多器官功能障礙的發(fā)生[4,14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，痰熱清注射液對膿毒癥大鼠的PCT及TNF－α的水平有明顯的降低作用，可提高膿毒癥大鼠的生存率，對膿毒癥有很好的治療作用。

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