射干麻黃湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥及外周血Th1/Th2平衡的影響

趙 紅 王長(zhǎng)海 魏亞強(qiáng)

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院（西安 710032）

哮喘的本質(zhì)是氣道炎癥，各種嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞反常聚集和激活參與了支氣管哮喘的調(diào)節(jié)。此外，許多研究已證實(shí)T1亞群細(xì)胞/T2亞群細(xì)胞(Th1/Th2）平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞活化亢進(jìn)在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1]。

大量臨床研究表明，中藥射干麻黃湯治療支氣管哮喘療效確切，具有遠(yuǎn)期療效穩(wěn)定、不良反應(yīng)少、毒副作用罕見(jiàn)等特點(diǎn)。但對(duì)其作用機(jī)制的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察射干麻黃湯對(duì)哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細(xì)胞、白細(xì)胞介素4(IL－4）和γ－干擾素(IFN－γ）/IL－4比率的影響，探討其對(duì)控制哮喘氣道炎癥和Th1/Th2細(xì)胞亞群失衡的影響，揭示其治療支氣管哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動(dòng)物：選取6周齡清潔級(jí)SD大鼠40只，雌性，體質(zhì)量（180±20）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(軍）2007－007。（2）藥物及試劑：卵蛋白干粉由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；地塞米松片（0.75mg/片），由上海信宜制藥股份有限公司生產(chǎn),批號(hào)020401；射干麻黃湯(射干9g，麻黃12g，半夏 12g，紫菀 9g，款冬花 9g，大棗 12g，細(xì)辛 3g，生姜 12g，五味子12g）組方藥材由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院中藥房提供；大鼠IL－4 ELISA試劑盒、IFN－γ ELISA試劑盒由北京晶美生物工程有限公司生產(chǎn)。（3）主要儀器：402型超聲霧化器由上海四菱醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；美國(guó)Beckman J 2型低溫高速離心機(jī)。

1.2 方法 （1）造模：按文獻(xiàn)[2]方法操作。實(shí)驗(yàn)用雌性大鼠40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘組、地塞米松組和射干麻黃湯組，每組10只。除正常組外，第0、7天于大鼠腹腔注射1mL的抗原液 (含卵蛋白100mg、氫氧化鋁干粉100mg、滅活百日咳桿菌5×109個(gè)）致敏，第7～21日用超聲霧化器給大鼠霧化吸入10g/L卵蛋白生理鹽水懸液，30min/d，至出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、撓鼻等哮喘發(fā)作表現(xiàn)。正常對(duì)照組：按哮喘組方法，用生理鹽水代替卵蛋白霧化吸入與腹腔注射。地塞米松組：自造模第1日起灌服地塞米松，劑量為1mg/(kg·d）。射干麻黃湯治療組：自造模第1日起，每日灌服射干麻黃湯劑20g/(kg·d），生藥含量2g/mL，每日1次，各組均連續(xù)用藥7d。（2）BALF收集：按文獻(xiàn)[3]方法操作。造模及相應(yīng)處理完成后24h，烏拉坦腹腔注射麻醉(1.5g/kg），結(jié)扎右肺門(mén)根部，行氣管插管，4mL生理鹽水緩慢注入肺內(nèi)，輕輕按摩肺組織30s，緩慢回抽，回收BALF，反復(fù)3次，回收率大于90%。取搖勻的BALF少許滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，然后將BALF離心(1000r/min離心10min），取適量沉渣制備細(xì)胞涂片，采用瑞氏染色法染色，油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并分類。（3）血漿標(biāo)本的采集：從頸動(dòng)脈取血3mL，加肝素鈉抗凝，靜置2h后，2000r/min離心15min，提取血漿保存于－20℃冰箱待測(cè)細(xì)胞因子。（4）細(xì)胞因子檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法行IL－4及IFN－γ水平檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以(）表示。采用 t檢驗(yàn)、Dunnett檢驗(yàn)和S－N－K法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況觀察 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠一般情況變化

2.2 各組BALF中炎癥細(xì)胞的比較 見(jiàn)表2。哮喘組大鼠細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組 (P＜0.01），2個(gè)治療組細(xì)胞總數(shù)及各炎癥細(xì)胞數(shù)較哮喘組明顯減少（P＜0.01）。地塞米松組嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)顯著低于射干麻黃湯組（P＜0.05），2個(gè)治療組間細(xì)胞總數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組BALF中炎癥細(xì)胞的變化 (×106/L，）

表2 各組BALF中炎癥細(xì)胞的變化 (×106/L，）

組 別正常對(duì)照組哮喘組地塞米松組射干麻黃湯組n 10 10 10 10細(xì)胞總數(shù)20.50±4.14 32.50±6.02*10.00±2.83△21.10±3.35△嗜酸性粒細(xì)胞0.40±0.20 3.94±0.53*1.71±0.54△2.25 ±0.68△▲中性粒細(xì)胞1.53±0.44 8.46±1.11*4.43±0.78△5.37±1.16△淋巴細(xì)胞1.32±0.43 8.05±1.07*2.76±0.91△3.66 ±0.68△▲

2.3 各組大鼠細(xì)胞因子水平的比較 見(jiàn)表3。哮喘組大鼠較正常組血清中IL－4明顯增加（P＜0.01），2個(gè)治療組大鼠較哮喘組血清中IL－4明顯減少（P＜0.01），射干麻黃湯組與地塞米松組血清中IL－4相近（P＞0.05）。哮喘組大鼠IFN－γ/IL－4較正常組明顯減少（P＜0.01），2個(gè)治療組大鼠較哮喘組大鼠血清中IFN－γ/IL－4明顯增加（P ＜0.01）；射干麻黃湯組與地塞米松組血清中IFN－γ/IL－4相近（P＞0.05）。

表3 各組外周血IL－4及IFN－γ/IL－4比較 (pg/mL,）

表3 各組外周血IL－4及IFN－γ/IL－4比較 (pg/mL,）

組 別正常對(duì)照組哮喘組地塞米松組射干麻黃湯組n 10 10 10 10 IL－4 35.29±5.66 59.73±11.96*42.43±7.02△40.65±5.78△IFN－γ 71.67±10.18 41.30±6.54*52.23±8.46△47.50±6.70△IFN－γ/IL－4 2.04±0.13 0.72±0.18*1.26±0.29△1.19±0.24△

3 討論

支氣管哮喘是由氣道免疫相關(guān)細(xì)胞的反?；罨途奂约癟淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞的功能障礙為特點(diǎn)的慢性氣道炎癥性疾病。氣道慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)，其不但可導(dǎo)致氣短、聲嘶、胸悶等癥狀，也決定了哮喘的嚴(yán)重程度。此外，研究表明，Th1/Th2免疫平衡決定機(jī)體對(duì)疾病的易感性，是哮喘發(fā)病和持續(xù)存在的主要免疫學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)Th2細(xì)胞反應(yīng)占主導(dǎo)時(shí)，Th1/Th2平衡發(fā)生改變，并在哮喘氣道炎癥細(xì)胞的趨化、成熟、存活過(guò)程中起著重要作用。因此，抑制Th2型反應(yīng)、增強(qiáng)Th1型反應(yīng)被認(rèn)為對(duì)哮喘的發(fā)病起防治作用[4]。

CD+4T淋巴細(xì)胞根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子不同分為T(mén)h1和Th2兩個(gè)亞群，不同亞群執(zhí)行著不同的免疫功能。Th1分泌IFN－γ、IL－2、TNF－α和 TNF－β，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th1通過(guò)增加細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá)，激活巨噬細(xì)胞，使炎癥細(xì)胞募集增多并且可以通過(guò)多種途徑擴(kuò)增免疫反應(yīng)，包括在抗原呈遞細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上增加MHCⅠ和MHCⅡ分子水平。當(dāng)感染中遇到較大的病原體而不被吞噬時(shí)，Th2細(xì)胞被激活。Th2主要產(chǎn)生 IL－4、IL－5、IL－10和 IL－13，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，在哮喘等過(guò)敏性炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。事實(shí)上，免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)環(huán)境因素的反應(yīng)，可以直接或間接影響CD+4T分化成Th1或Th2細(xì)胞，從而產(chǎn)生自身免疫性疾病和過(guò)敏。

IFN－γ、IL－4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，二者在哮喘發(fā)病中從正反兩方面控制CD+4T細(xì)胞的分化和功能[6]。IFN－γ由Th1細(xì)胞分泌，可以誘導(dǎo)CD+4T細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞，還可以抑制Th2細(xì)胞的分化。另一方面，由Th2細(xì)胞分泌的IL－4可以誘導(dǎo)CD+4T細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞，還可以抑制Th1細(xì)胞的功能。當(dāng)Th2細(xì)胞反應(yīng)占主導(dǎo)時(shí)，Th1/Th2平衡發(fā)生改變，引起各種過(guò)敏性疾病。對(duì)此方面的研究已成為哮喘免疫治療的熱點(diǎn)之一[7，8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增多，提示發(fā)生了以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道炎癥，經(jīng)灌服射干麻黃湯及地塞米松后，大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞較哮喘組明顯減少，說(shuō)明射干麻黃湯和地塞米松組均有抑制氣道炎癥作用，但與地塞米松比較，射干麻黃湯對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的作用較低。對(duì)外周血中IFN－γ、IL－4水平監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠BALF中IFN－γ蛋白水平明顯下調(diào)，IL－4蛋白水平明顯上調(diào)，表現(xiàn)出明顯的Th2細(xì)胞因子分泌亢進(jìn)和Th1細(xì)胞因子減少，再次證實(shí)哮喘中Th1/Th2的免疫失衡，Th2細(xì)胞活化亢進(jìn)的存在。在灌服射干麻黃湯及地塞米松后發(fā)現(xiàn)IL－4水平下調(diào)，IFN－γ/IL－4明顯增加，使IFN－γ/IL－4比例得以逆轉(zhuǎn),這與Deng等[9]在大鼠中觀察到的現(xiàn)象相似。說(shuō)明射干麻黃湯與地塞米松均可抑制Th2活化，影響Th1/Th2水平，且射干麻黃湯與地塞米松作用相當(dāng)。

射干麻黃湯出自漢代張仲景《金匱要略》，由射干、麻黃、款冬花、細(xì)辛、紫菀、半夏、五味子、大棗、生姜等組成，可“宣肺散寒，化飲止咳，治外感風(fēng)寒，痰飲上逆，咳而上氣，喉中有水鳴聲”。方中麻黃宣肺散寒，射干開(kāi)結(jié)消痰，并為君藥；生姜散寒行水，半夏降逆化飲，共為臣藥；紫菀、款冬花溫潤(rùn)除痰，下氣止咳，五味子收斂耗散之肺氣，均為佐藥；大棗益脾養(yǎng)胃，為使藥。諸藥相配，融解表、溫肺、利氣、開(kāi)痰于一方以分解病邪，共奏溫肺散寒、化痰平喘之功。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)射干麻黃湯干預(yù)哮喘大鼠模型，證實(shí)了射干麻黃湯可以緩解氣道炎癥，調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫失衡，抑制Th2細(xì)胞活化，這可能是其治療支氣管哮喘的作用機(jī)制之一，提示射干麻黃湯在治療哮喘方面具有良好的應(yīng)用前景。

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