熱哮方對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響

任 勤

天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（天津 300193）

熱哮方是經(jīng)多年臨床總結(jié)研制的治療小兒哮喘熱哮證的有效方劑。筆者采用動物實驗對其抗氣道變應性炎癥，降低氣道高反應性的藥理作用進行觀察。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1）試驗藥物：熱哮方組成為麻黃6g，白果10g，杏仁 10g，蘇子 10g，半夏 10g，款冬花 10g，桑白皮 10g，黃芩 10g，地龍10g，桃仁10g，甘草6g，經(jīng)水煎制成含生藥1g/mL；普米克令舒由阿斯利康公司生產(chǎn)。(2）動物：健康清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各半，4～5周齡,體質(zhì)量180～200g，由北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。購入后按雌雄各半隨機分組，在天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院二級動物室適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。(3）試劑：卵蛋白（OVA）購自天津華生生物科技有限公司；中性粒細胞蛋白酶水解酶(NE）、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP－9）及其抑制劑(TIMP－1）定量ELISA試劑盒購自北京尚柏生物醫(yī)學科技有限公司；白細胞介素4(IL－4）、γ干擾素 (IFN－γ）定量ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 方法 (1）造模：第1日各組大鼠大腿內(nèi)側(cè)皮下注射OVA懸液1mL（含OVA 10mg、氫氧化鋁200mg，生理鹽水混合至1mL），同時腹腔內(nèi)注射滅活百日咳桿菌懸液1mL（約6×109個菌株）作為佐劑，第8日重復致敏1次，第15日將大鼠置于自制玻璃容器中，用壓縮霧化吸入機給予中等霧量（4L/min）的2%OVA懸液激發(fā)3min，每日1次，共5周。卵蛋白懸液激發(fā)后以大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快、行動遲緩或俯伏不動等癥狀為哮喘激發(fā)成功。(2）分組與給藥：將動物隨機分為空白對照組、模型組、熱哮方組、普米克令舒組、熱哮方聯(lián)合普米克令舒組，每組8只。于第15日開始對空白對照組、模型組每日上午給予生理鹽水1mL灌胃，下午吸入生理鹽水，持續(xù)噴霧3min；熱哮方組上午給予熱哮方灌胃[9g生藥/(100g·d）]，下午吸入生理鹽水；普米克令舒組每日上午給予生理鹽水1mL灌胃，下午于誘喘前30min霧化吸入普米克令舒[60μg/(100g·d）]；熱哮方聯(lián)合普米克令舒組每日上午給予熱哮方灌胃，下午于誘喘前30min霧化吸入普米克令舒，藥物劑量同上，共5周。末次激發(fā)結(jié)束后24h內(nèi)用25%烏拉坦2.5g/kg腹腔麻醉大鼠，固定，無菌操作行腸系膜下靜脈穿刺采血5mL，于4℃以3000r/min離心10min，分離沉淀物及上清液。血清置于－70℃?zhèn)溆?。采血后，肺組織用10%中性甲醛溶液3mL進行肺泡灌注固定，暴露胸腔，去大鼠氣管、支氣管一部分，并置于10%中性甲醛溶液固定。石蠟包埋，切片(5μm，每個標本切 3 片）。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用 F檢驗和 q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿IL－4、INF－γ含量比較 見表1。IL－4含量模型組較空白對照組明顯升高（P＜0.05）；各用藥組IL－4含量均低于模型組（P＜0.05）；熱哮方組與普米克令舒組作用相當（P＞0.05）；熱哮方聯(lián)合普米克合舒組與熱哮方組、普米克令舒組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組較空白對照組INF－γ含量明顯降低（P＜0.05），各用藥組INF－γ含量均高于模型組（P＜0.05），各但用藥組之間相近(P＞0.05）。

表1 各組IL－4、INF－γ含量比較（ng/L，）

表1 各組IL－4、INF－γ含量比較（ng/L，）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與熱哮方組比較，▲P ＜0.05；與普米克合舒組比較，〇P ＜0.05。下同

組 別空白對照組模型組熱哮方組普米克令舒組熱哮方聯(lián)合普米克令舒組n88888 IL－4 13.28±1.29 31.02±3.14*18.34±1.36*△17.37±1.66*△14.11±1.96*△▲〇INF－γ 81.11±11.5 32.03±6.69*55.06±6.98*△51.20±8.32*△56.97±10.42*△

2.2 各組中性粒細胞浸潤的氣道炎癥指標比較 見表2。模型組大鼠血清中中性粒細胞蛋白酮水解酶 (NE）的OD值明顯升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各用藥組NE OD值均低于模型組（P＜0.05）。熱哮方組與普米克令舒組作用相當（P＞0.05）。熱哮方聯(lián)合普米克令舒組NE降低幅度顯著大于熱哮方組、普米克令舒組（P＜0.05）；熱哮方組與普米克令舒組情況相近（P＞0.05）。

表2 各組血清NE水平比較（）

表2 各組血清NE水平比較（）

組 別空白對照組模型組熱哮方組普米克合舒組熱哮方聯(lián)合普米克令舒組n88888 NE的OD值0.476±0.231 0.878±0.175*0.677±0.185*△0.666±0.218*△0.512±0.162*△▲〇

2.3 各組MMP－9、TIMP－1的含量及TIMP－1/MMP－9比值的比較 見表3。各組血清中MMP－9的含量均高于空白對照組（P ＜0.05）；各治療組與模型組相近（P＞0.05）。各組血清中TIMP－1的含量均明顯高于空白對照組（P＜0.05），各治療組明顯低于模型組，熱哮方聯(lián)合普米克令舒組降低最明顯（P＜0.05），熱哮方組與西藥組相近（P＞0.05）。與對照組比較，各組TIMP－1/MMP－9均明顯高于空白對照組（P＜0.01）；與模型組比較，各組均明顯低于模型組（P＜0.05）；熱哮方聯(lián)合普米克令舒組與熱哮方組、普米克令舒組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；熱哮方組與普米克令舒組相近（P＞0.05）。結(jié)果提示治療組血清TIMP－1的含量及TIMP－1/MMP－9的比值均明顯降低，熱哮方聯(lián)合普米克令舒組效果最優(yōu)，熱哮方組與普米克令舒組療效相當。

表3 各組血清MMP－9、TIMP－1含量比較（ng/mL，）

表3 各組血清MMP－9、TIMP－1含量比較（ng/mL，）

組 別空白對照組模型組熱哮方組普米克令舒組熱哮方聯(lián)合普米克令舒組n 8 8 8 8 8 MMP－9 3.124±0.561 6.557±1.445*5.652±1.887*6.462±0.470*5.946±1.170*TIMP－1 1.122±0.18 13.282±2.038*10.872±3.193*△10.721±2.724*▲7.153±0.557*△▲〇TIMP－1/MMP－9 0.36±0.07 2.12±0.18*1.77±0.13*△1.67±0.45*△1.25±0.17*△▲〇

2.4 各組氣道壁厚度變化的比較 見表4。應用德國LeicaQ500Mc圖像分析系統(tǒng)進行氣道黏膜、平滑肌厚度的測定。結(jié)果示，熱哮方組、普米克令舒組、熱哮方聯(lián)合普米克令舒組氣道黏膜厚度變化與模型組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），3組之間相近（P＞0.05）。熱哮方組、普米克令舒組、熱哮方聯(lián)合普米克令舒組氣道平滑肌厚度變化與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），3組之間相近（P＞0.05）。提示熱哮方組、普米克令舒組、熱哮方聯(lián)合普米克令舒組氣道黏膜、平滑肌厚度均降低，氣道炎癥反應改善。

表4 各組氣道壁厚度比較（μm，）

表4 各組氣道壁厚度比較（μm，）

平滑肌92.28±5.53 139.52±10.78*96.70±21.30△94.23±9.66△94.09±7.98△組 別空白對照組模型組熱哮方組普米克令舒組熱哮方聯(lián)合普米克令舒組n88888黏膜39.14±9.65 65.31±5.53*43.85±12.71△42.16±7.60△41.30±5.50△

2.5 對氣道的作用 在光學顯微鏡下,根據(jù)氣道變化程度，管腔及管壁炎癥的情況等進行觀察。空白對照組氣道壁薄，氣管黏膜結(jié)構完整，氣道平滑肌薄，未見明顯炎性細胞反應，無炎性物質(zhì)滲出。模型組氣道壁明顯增厚，氣道黏膜皺襞增多，氣道黏膜及平滑肌的厚度明顯增加，黏膜下、管壁均有大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤，管腔狹窄。熱哮方組氣道壁增厚皺襞增多，較模型組輕，氣道黏膜及平滑肌的厚度明顯較模型組薄，支氣管炎性細胞浸潤明顯輕于模型組。普米克令舒組氣道壁及皺襞稍增厚，氣道黏膜及平滑肌的厚度與中藥組相類似，炎性細胞浸潤較熱哮方組稍輕。熱哮方聯(lián)合普米克令舒組氣道壁及皺襞輕微增厚，氣道黏膜及平滑肌的厚度與空白對照組相類似，炎性細胞浸潤較中藥組稍輕。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為氣道炎癥和重塑是哮喘的兩個主要病理學特征[1]。糖皮質(zhì)激素是有效的抗氣道變應性炎癥藥物，可在多個環(huán)節(jié)阻斷氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展，但不能逆轉(zhuǎn)氣道重建。通過20余年的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)熱哮為哮喘最多見證型，因此我們研制以宣肺清熱，滌痰散瘀，止咳平喘為大法之熱哮方，臨床取得滿意療效。

3.1 調(diào)節(jié)T輔助細胞 (Th細胞）：Th1/Th2網(wǎng)絡失衡的氣道炎癥 新近研究表明[2]哮喘的免疫學發(fā)病機制為：Ⅰ型樹突狀細胞(DCⅠ）成熟障礙，使Th0不能向Th1細胞分化，在IL－4誘導下DCⅡ促使Th0向Th2發(fā)育，導致Th1（分泌IFN－γ減少）、Th2（分泌IL－4增高）細胞功能失衡。Th2細胞促進B細胞產(chǎn)生大量IgE和分泌炎性細胞因子，產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)，最終誘發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應和慢性氣道炎癥。實驗表明，大鼠哮喘模型治療前血IL－4含量明顯升高，血IFN－γ明顯降低，治療后3組IFN－γ/IL－4比值均糾正，進而Th1/Th2網(wǎng)絡功能失衡改善，哮喘控制，可減輕氣道的慢性炎癥，且以中西組效果最優(yōu)。

3.2 抑制大量中性粒細胞（PMN）浸潤的氣道炎癥 PMN含有多種蛋白水解酶，對組織損傷最大的是NE。NE是一個促進杯狀細胞過度分泌的蛋白酶，可引起黏液腺過度增生和黏液分泌增多，同時導致上皮細胞損傷、纖維組織破壞等。破壞主要作用主要是降解基底膜的彈性蛋白。在哮喘發(fā)作時NE明顯增多，激素對中性粒細胞治療反應差，且激素可延長中性粒細胞的存活[3]。本實驗表明，模型組大鼠血清中NE的OD值明顯升高；用藥各組NE的OD均低于模型組（P＜0.05）；熱哮方聯(lián)合普米克令舒組情況優(yōu)于熱哮方組、普米克令舒組，從而減輕PMN浸潤的氣道炎癥作用。

3.3 對氣道重塑的干預 基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP）主要降解細胞外基質(zhì)（ECM），其作用受其組織抑制因子TIMP特異性抑制，MMP－9及TIMP－1在不同時期的過度表達以及二者表達的比例失衡,是支氣管哮喘氣道炎癥與重構的重要機制之一[4],過度的MMPs表達與ECM的降解有關,而TIMPs的過度上調(diào),可能導致組織的異常修復,引起氣道壁重構。本實驗表明，模型組血清中TIMP－1含量、TIMP－1/MMP－9比值均明顯增高，各用藥組均能明顯降低比值，中西組效果最優(yōu)，中藥組與西藥組療效相當。提示3組方法均可明顯降低血清TIMP－1含量及TIMP－1/MMP－9的比值，從而抑制組織的異常修復,減少氣道壁重構的發(fā)生，且以中西組效果最優(yōu)。

3.4 對哮喘氣道炎癥結(jié)構的作用 本實驗表明，模型組氣道壁明顯增厚，氣道黏膜皺襞增多，氣道黏膜及平滑肌的厚度明顯增加，黏膜下、管壁均有大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤，管腔狹窄。用藥各組均能直接減輕氣道黏膜及平滑肌厚度，改善氣道炎癥細胞的浸潤。

綜上所述，宣肺清熱、滌痰散瘀、解痙平喘之熱哮方可能是通過降低血清中IL－4、提高INF－γ含量以糾正Th1/Th2網(wǎng)絡功能失衡，進而控制哮喘發(fā)作，減輕氣道慢性炎癥。此外還可降低NE含量以減輕中性粒細胞浸潤的氣道炎癥；降低TIMP－1含量及TIMP－1/MMP－9的比值，抑制氣道重塑，并能直接減輕氣道黏膜及平滑肌厚度，改善氣道炎癥細胞的浸潤。因此宣肺清熱、滌痰散瘀、解痙平喘之熱哮方對哮喘氣道炎癥和氣道重塑有明顯改善作用。同時本實驗表明，中西醫(yī)結(jié)合組優(yōu)勢明顯，是最佳的治療方式。

[1]Lenfant C.Global strategy for asthma management and prevention Maryland：National[S].Institute of Health(USA）,1995：6 ～ 47.

[2]William OC,Cookson M,Moffatt MF.Asthma，anepidemic in the absence of infection[J].Science,1997,275(5296）：41 ～ 42.

[3]何麗，郭盛，熊先敏，等.扶正化痰法對哮喘豚鼠血清IL－8、TNF － α 影響研究[J].中醫(yī)藥學刊，2003，21(2）：280.

[4]Kuropkat C,Plehn S,Herz U,et al.Tumor marker potential of serum matrix metalloproteinase in patients with head and neck cancer[J].Anticancer Res,2002，22(4）：2221.