下頜骨節(jié)段性缺損修復(fù)組織工程中珊瑚支架殘留率的研究

袁捷，劉廣鵬，韋敏，祁佐良，崔磊，曹誼林

修復(fù)因創(chuàng)傷、感染、腫瘤等導(dǎo)致的下頜骨缺損是臨床常見疾病，自體骨移植是目前療效最佳的治療手段，但因患者不但需承受自身供區(qū)的明顯損傷，供區(qū)來源也受限，同時(shí)也存在創(chuàng)口感染、血腫形成、取骨區(qū)疼痛等諸多并發(fā)癥[1-2]，所以在整復(fù)外科領(lǐng)域，目前下頜骨缺損的修復(fù)仍是難題。因此，尋找更好的下頜骨整復(fù)治療方法備受關(guān)注。

新興的組織工程技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，如良好恢復(fù)損傷組織正常結(jié)構(gòu)和功能，支架材料可任意塑形且對(duì)供體部位損傷小，為修復(fù)下頜骨缺損提供了新的思路。所以應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)承力下頜骨缺損是目前研究的熱點(diǎn)。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cell，BMSC）已被證明是較好的種子細(xì)胞來源[3]。我們?cè)谇捌谝殉晒Φ貞?yīng)用成骨誘導(dǎo) BMSC 分別復(fù)合珊瑚和珊瑚羥基磷灰石修復(fù)了犬下頜骨 3cm的節(jié)段缺損，與珊瑚組織工程骨相比，羥基磷灰石組織工程骨有較多材料殘留，修復(fù)效果相對(duì)較差[4-6]。就組織工程的目的而言，希望支架最終能隨新生組織的形成逐步降解，由此達(dá)到接近自然的良好修復(fù)。但珊瑚作為支架在組織工程骨內(nèi)降解速率如何目前尚無定論。為此本實(shí)驗(yàn)分別采用成骨誘導(dǎo) BMSC復(fù)合珊瑚構(gòu)建組織工程骨修復(fù)犬下頜骨 3cm的標(biāo)準(zhǔn)節(jié)段缺損，通過觀察比較此珊瑚組織工程骨在不同時(shí)間段支架材料降解情況確定其最終修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

地塞米松、β-磷酸甘油鈉、2-磷酸抗壞血酸和DMEM 培養(yǎng)液購自美國 Sigma公司；雜交犬購自上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院；珊瑚為海南三亞產(chǎn)濱珊瑚。固定鈦板、鈦釘由常州康輝醫(yī)療器有限責(zé)任公司提供；μ80 顯微 CT（Micro-CT）為瑞士 Scanco medical公司產(chǎn)品；AG-1（Ver.3.80）生物力學(xué)測(cè)試儀為日本 Shimdzu公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BMSC的分離、誘導(dǎo)培養(yǎng) 5%的戊巴比妥鈉（0.5ml/kg）麻醉 12只犬后，均抽取骨髓 3～4ml，PBS 洗滌，600×g 離心 5 min，去上層脂滴，4×104個(gè)有核細(xì)胞/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中，加含有地塞米松（10 nmol/L）、β-磷酸甘油鈉（2.16 g/L）和2-磷酸抗壞血酸（37.5 mg/L）的成骨條件培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5d后PBS 洗去未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液。待BMSC 大部分融合，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，以0.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種，培養(yǎng)至第 2 代接種珊瑚材料。

1.2.2 BMSC 細(xì)胞-珊瑚復(fù)合物的植入 12只成年雜交犬，分為2組，每組6只，體重 19～22 kg，術(shù)前 8周拔除右側(cè)上下全部前磨牙及第一磨牙預(yù)防感染；同時(shí)拔除左側(cè)上下全部前磨牙及第一磨牙，作為生物力學(xué)測(cè)試正常組，即對(duì)照組。5%的戊巴比妥鈉（0.5ml/kg）麻醉，術(shù)中靜脈滴注青霉素 160萬單位抗炎。右側(cè)臥位，頜下皮膚切開進(jìn)入，暴露下頜骨體，置入鈦板，近遠(yuǎn)中各 3 枚鈦釘固定，線鋸離斷形成 3cm節(jié)段缺損，去除骨膜，局部骨蠟填塞止血。隨后將誘導(dǎo)細(xì)胞 BMSC-珊瑚組珊瑚復(fù)合物植入缺損處，逐層關(guān)創(chuàng)。術(shù)后隔日起青霉素 80萬單位肌肉注射（每天 2 次×3 d），防止感染，并進(jìn)流質(zhì)（半流質(zhì)）飼養(yǎng)。術(shù)后22周全部拆除鈦板。

1.2.3 節(jié)段缺損處的立體骨密度和珊瑚殘留率的測(cè)定 采用靜脈空氣栓塞處死術(shù)后12周和32周各 6只動(dòng)物，鋸下雙側(cè)下頜骨標(biāo)本，采用Micro-CT測(cè)定標(biāo)本節(jié)段缺損處組織的立體骨密度（閾值設(shè)為25% 最大灰度值）和珊瑚殘留率（閾值設(shè)為46.5% 最大灰度值），掃描層厚度均為50μm×50 μm×50 μm。

1.2.4 大體形態(tài)結(jié)構(gòu)、新骨形成和珊瑚降解的觀察 BMSC-珊瑚組犬術(shù)后12周和32周時(shí)，取材后各取 6只下頜骨觀察大體形態(tài)結(jié)構(gòu)，隨后4%多聚甲醛固定標(biāo)本，梯度酒精脫水，以聚甲基丙烯酸甲脂包埋，行包括連接處縱切面的硬組織切片，厚度 50 μm；之后行苦味酸-品紅（Van Gieson）染色，并采用組織形態(tài)測(cè)定法[5]定量觀察新骨形成和珊瑚降解情況。

1.2.5 生物力學(xué)的檢測(cè) 12周及32周時(shí)，BMSC-珊瑚組和對(duì)照組下頜骨標(biāo)本各取 6只，以75% 酒精擦凈、吹干后，采用生物力學(xué)測(cè)試儀行整骨咬合向三點(diǎn)彎曲測(cè)試（以自凝義齒基托樹脂固位），跨距為30 mm，受力截面積設(shè)為長(zhǎng)方形，位于植入物中央，加載速度 0.5mm/min，最大彎曲強(qiáng)度=3LF/（2WT2），彈性模量=L3F/（4WT3⊿l），其中 W 為寬度；T 為厚度；L 為跨距；F 為最大載荷；⊿l 為最大彎距。后兩者在三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中測(cè)出。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用方差分析和Student t test 方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)軟件包為SAS Ver.6.12。

2 結(jié)果

所有犬術(shù)后傷口無感染，早期輕度腫脹。術(shù)后2 d開始進(jìn)食流質(zhì)，1周后進(jìn)食半流質(zhì)。

2.1 節(jié)段缺損處的立體骨密度和珊瑚殘留率

術(shù)后12周誘導(dǎo) BMSC-珊瑚組新骨形成較好，剖面有孔隙結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，但仍可見支架結(jié)構(gòu)明顯殘留；術(shù)后32周伴隨珊瑚材料逐步降解新骨進(jìn)一步成熟，但與正常下頜骨比較，尚無明顯的下頜管腔形成（圖 1）。

圖1 術(shù)后立體骨密度和珊瑚殘留率的Micro-CT 圖像（A：BMSC-珊瑚組12周；B：BMSC-珊瑚組32周；C：自體對(duì)照組32周）Figure1 Micro-CT images of density of bone volume and residual material volume post- operation.A: BMSC-coral group at 12 weeks; B:BMSC-coral group at 32 weeks; C: The normal control group at 32 weeks.

術(shù)后12周骨組織的平均密度（density of bone volume，DBV）BMSC-珊瑚組為（562.76±85.68）mg HA/cm3顯著高于對(duì)照組[（474.04±86.85）mg HA/cm3，P＜0.05]。術(shù)后32周 BMSC-珊瑚組DBV（554.3±59.43）mg HA/cm3也顯著高于對(duì)照組[（469.36±67.74）mg HA/cm3，P＜0.05]。就支架殘留率（residual material volume，RMV）而言，BMSC-珊瑚組術(shù)后12周為（21.44±4.33）%，顯著高于術(shù)后32周的[（14.46±2.94）%，P＜0.01]。

2.2 大體形態(tài)結(jié)構(gòu)、新骨形成和珊瑚降解

BMSC-珊瑚組12周和32周均可見骨缺損已較好修復(fù)，斷端處為骨樣連接（圖 2）。Van Gieson染色顯示術(shù)后12周誘導(dǎo) BMSC-珊瑚組已形成良好骨組織，有類哈弗系統(tǒng)結(jié)構(gòu)形成，珊瑚支架材料有較多殘留；術(shù)后32周可見骨進(jìn)一步成熟形成板層骨結(jié)構(gòu)，且珊瑚支架材料有較多降解（圖 3）。通過圖像分析可知，BMSC-珊瑚組術(shù)后32周新骨量為（60.66±8.09）%，顯著高于術(shù)后12周的[（46.74±5.17）%，P＜0.05]，RMV 術(shù)后12周為（24.17±5.44）%，則顯著高于術(shù)后32周的[（11.63±3.29）%，P＜0.01]，與Micro-CT 檢測(cè)結(jié)果一致。

圖2 術(shù)后BMSC-珊瑚組下頜骨標(biāo)本的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)（A：12周；B：32周）Figure2 Gross view of repaired mandibles post-operation in BMSC-coral group.A: 12 weeks; B: 32 weeks

圖3 采用組織學(xué) Van Gieson 染色方法觀察術(shù)后BMSC-珊瑚組新骨形成和珊瑚降解情況（A.：12周；B：32周）（100×）Figure3 Using Van Gieson’s Picro-fuchsine staining to observe the new bone formation and coral degradation post-operation.A: at 12 weeks; B: I 32 weeks (100×)

2.3 生物力學(xué)

術(shù)后12周時(shí)，BMSC-珊瑚組最大載荷為（1.74±0.37）KN，達(dá)到對(duì)照組的73.5%；BMSC-珊瑚組最大彎曲強(qiáng)度為（33.43±9.47）MPa，達(dá)到對(duì)照組的81.67%；均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。術(shù)后32周時(shí)，BMSC-珊瑚組最大載荷為1.52±0.42 KN，達(dá)到對(duì)照組的86.37%；BMSC-珊瑚組最大彎曲強(qiáng)度為（54.4±9.88）MPa，達(dá)到對(duì)照組的90.8%，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。術(shù)后12周 BMSC-珊瑚組彈性模量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而 BMSC-珊瑚組術(shù)后32周最大彎曲強(qiáng)度顯著高于術(shù)后12周（P＜0.05），表明BMSC-珊瑚組下頜骨隨時(shí)間延長(zhǎng)珊瑚材料逐步降解，其力學(xué)強(qiáng)度也有顯著提高（表1）。

表1 術(shù)后下頜骨標(biāo)本各項(xiàng)生物力學(xué)測(cè)試參數(shù)Table1 Biomechanical analyses of repaired mandibles at 12 and 32 weeks post-operation

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用珊瑚作為細(xì)胞載體，一方面是因?yàn)樯汉鞯目紫堵史铣晒羌?xì)胞的寄居要求，另一方面珊瑚的力學(xué)強(qiáng)度較高，具有與松質(zhì)骨相類似的力學(xué)性能，有較高的壓應(yīng)力（可達(dá) 6 MPa），可以滿足承力骨要求[7]，且其有較好的降解性，這對(duì)組織工程骨尤為重要，因降解緩慢的材料在骨修復(fù)過程中會(huì)占據(jù)新骨形成空間，并產(chǎn)生應(yīng)力遮擋作用，從而影響骨愈合。在我們先前實(shí)驗(yàn)中，雖已應(yīng)用珊瑚復(fù)合成骨 BMSC 構(gòu)建了組織工程下頜骨，但具體材料降解速率尚需進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)中通過Micro-CT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)珊瑚組織工程骨支架殘留率術(shù)后32周較 12周顯著減少（殘留率 11%～15%）；組織學(xué)圖像分析也進(jìn)一步加以證實(shí)，而生物力學(xué)強(qiáng)度則隨時(shí)間增長(zhǎng)顯著增強(qiáng)（術(shù)后32周達(dá)到正常組的90.8%），提示我們珊瑚支架材料配合新骨形成逐步降解，最終下頜骨達(dá)到了較好修復(fù)。

單純珊瑚在體內(nèi) 3個(gè)月完全降解吸收，與我們先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相符合[7-8]。就復(fù)合 BMSC 修復(fù)骨缺損而言，珊瑚的降解速率卻有所不同。Petite等[9]在修復(fù)羊跖骨標(biāo)準(zhǔn)缺損時(shí)發(fā)現(xiàn)術(shù)后16周珊瑚殘留率 2%，而 Geiger等[10]在修復(fù)兔橈骨標(biāo)準(zhǔn)缺損時(shí)發(fā)現(xiàn)術(shù)后16周時(shí)珊瑚殘留率 6%。本實(shí)驗(yàn)中術(shù)后12周珊瑚殘留率 （21.44±4.33）%，術(shù)后32周 殘留（14.46±2.94）%，組織學(xué)圖像分析結(jié)果也基本與之相符。造成珊瑚材料降解速率不同的原因可能與修復(fù)部位不同有關(guān)，前二者都為負(fù)重骨缺損，相對(duì)承力較下頜骨更高，較高的受力強(qiáng)度造成局部材料降解速度也較快[11-12]。

此外，同樣是可降解的多孔磷酸三鈣材料，由于其初始強(qiáng)度較低（2MPa 左右），我們?cè)谛迯?fù)同樣犬下頜骨缺損時(shí)，曾發(fā)現(xiàn)單純材料組有 1 例早期斷裂，提示我們應(yīng)用此材料構(gòu)建組織工程骨修復(fù)大塊骨缺損時(shí)早期仍要承擔(dān)一定的風(fēng)險(xiǎn)。此外，磷酸三鈣材料降解較慢，術(shù)后32周仍有較多材料殘留，長(zhǎng)期而言新骨質(zhì)量比大部分降解的珊瑚材料組織工程骨稍差[13]。

綜上所述，術(shù)后下頜骨中珊瑚支架殘留率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，而生物力學(xué)強(qiáng)度則隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增強(qiáng)，達(dá)到了較好的修復(fù)效果；其具體參數(shù)的明確也為臨床應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)頜面承力骨缺損進(jìn)一步提供了有益的例證。

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