小麥矮腥黑粉菌及其近緣種的RPB2基因片段序列分析

高 飛, 高 利, 劉太國(guó), 高繼國(guó), 陳萬(wàn)權(quán)*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerases)在基因表達(dá)的過(guò)程中扮演著很重要的角色。早在1984年以前,生物化學(xué)家就已經(jīng)在真核生物中成功地分離出3種RNA聚合酶[1]。其中,RNA聚合酶II由12個(gè)亞基組成(RPB1～RPB12),負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄生成hnRNA和 mRNA[2]。RPB2(the second largest RNA polymerase subunit)基因負(fù)責(zé)編碼RNA聚合酶II的第2大亞基,具有單拷貝和進(jìn)化速率慢的特點(diǎn)[3]。RPB2基因片段與其他不同基因片段如ITS(internal transcribed spacer)、RPB1 、EF(elongation factor)等相結(jié)合,目前已廣泛地應(yīng)用于真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究[4-6]。

小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn,簡(jiǎn)稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國(guó)際檢疫性病害,對(duì)小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危害[7-8],也是我國(guó)外來(lái)生物入侵研究的主要物種之一[9]。與其近緣的小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌也是引起小麥病害的重要病原菌。3種真菌在形態(tài)學(xué)上極為相似,難以區(qū)別。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,從分子水平上尋找三者的差異成為植病學(xué)者研究的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

小麥矮腥黑粉菌共12個(gè)菌株分別來(lái)源于美國(guó)(11個(gè))、捷克(1個(gè)),小麥光腥黑粉菌(T.laevis Kühn,簡(jiǎn)稱 TLK)共 6個(gè)菌株,除 1個(gè)來(lái)自捷克外,其余來(lái)自國(guó)內(nèi)不同地區(qū),均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存;小麥網(wǎng)腥黑粉菌[T.caries(DC.)Tul.,簡(jiǎn)稱 TCT]共8個(gè)菌株,除1個(gè)來(lái)自捷克外,其余由重慶大學(xué)王中康教授提供。此外,還選用了相近的其他6種真菌(見(jiàn)表1)。

表1 供試菌株及來(lái)源

1.1.2 試劑與儀器

Taq DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技公司;克隆載體p MD18-T、IPTG、X-Gal購(gòu)于寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠試劑盒購(gòu)于Axygen公司;試驗(yàn)中涉及的引物及設(shè)計(jì)的特異引物由上海生物工程公司合成。高速冷凍離心機(jī)(Sigma)、紫外分光光度計(jì)(Nano Drop)、PCR儀(MJ Research)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)等儀器由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組配備。

1.2 基因組DNA的提取

采用改良的SDS法提取基因組DNA[10],DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用Nano Drop公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各個(gè)菌系DNA濃度與純度。

1.3 RPB2基因片段的擴(kuò)增

擴(kuò)增RPB2基因片段的引物為RPB2-740F/RPB2-1365R(RPB2-740F:GATGGACGCGGTTTGTAATG;RPB2-1365R:TCGAAGAGCYAACACTGAGACG)[6]。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃10 min。

PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包含:10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+(25 mmol/L)2 μL 、dNTPs(10 mmol/L)0.3μL、Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.3 μL、引物(10 μmol/L)各 1 μL 、DNA 模板(20 ng/μL)1μL、用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳后在紫外燈下將擴(kuò)增的條帶切下,用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化(Axygen公司)。純化后的產(chǎn)物連接到載體pMD18-T上(TaKaRa公司),轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)藍(lán)白斑篩選,挑取白色菌落經(jīng)過(guò)菌液PCR及質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆子后,交由上海生物工程公司測(cè)序。

1.5 序列分析及比對(duì)

將3種小麥腥黑粉菌的RPB2基因片段的序列用DNAMAN軟件進(jìn)行分析,比對(duì)它們之間的序列差異,并將3種小麥腥黑粉序列片段在GenBank上進(jìn)行同源序列比較。

1.6 將RPB2通用引物作為TCK特異引物的內(nèi)置對(duì)照引物擴(kuò)增

以RPB2的通用引物作為小麥腥黑粉菌屬的內(nèi)置對(duì)照引物與小麥矮腥黑粉菌特異性引物CQUTCK2/CQUTCK3(CQUTCK2:TCTAACTTACCTCGCGGATGG;CQUTCK3:ACGCAGTGACGGGTGGATA)[11]相結(jié)合進(jìn)行共同擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃10 min。

PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包含:10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+(25 mmol/L)2 μL 、d NTPs(10 mmol/L)0.3μL、Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.3 μL、引物 CQUTCK2/CQUTCK3,RPB2-740F/RPB2-1365R(10 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板(20 ng/μL)1μL、用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。

2 結(jié)果

2.1 RPB2基因片段的擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)3種小麥腥黑粉菌的不同菌株及相近的3個(gè)屬的6種真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌均能擴(kuò)增出一條大約600 bp的條帶,而與小麥腥黑粉菌相近的其他6種真菌均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。說(shuō)明該通用引物可以作為小麥腥黑粉菌的特異性引物區(qū)分與其近似的其他黑粉菌。

圖1 RPB2基因引物RPB2-740F/RPB2-1365R對(duì)不同真菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增

2.2 RPB2基因片段的測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明,小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌擴(kuò)增的 RPB2基因片段大小均為617 bp,G+C含量差別很小,分別為59.6%、59.5%和 59.5%。說(shuō)明三者的親緣關(guān)系較近。

2.3 RPB2基因片段序列分析

通過(guò)BLAST將小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌所測(cè)序列分別與其對(duì)應(yīng)的GenBank中已經(jīng)公布的同源序列(EU257590、EU257596、EU257607)比 對(duì),相 似 性 分 別 為97.96%、97.59%和97.27%,表明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確。再通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行分析,3種小麥腥黑粉菌的RPB2基因片段相似性為99.08%,存在著17個(gè)堿基的差異(圖2)。其中,小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌親緣關(guān)系更近。

圖 2 TCK、TCT和TLK的RPB2基因序列測(cè)序結(jié)果

2.4 RPB2基因的通用引物作為內(nèi)置對(duì)照引物的擴(kuò)增結(jié)果

引物 CQUTCK2/CQUTCK3、RPB2-740F/RPB2-1365R分別能擴(kuò)增出747 bp和617 bp的條帶。將2對(duì)引物相結(jié)合進(jìn)行PCR擴(kuò)增,TCK可以擴(kuò)增出747 bp和617 bp的2條帶,3種小麥腥黑粉菌均能擴(kuò)增出617 bp的條帶,而其他6種真菌均不能擴(kuò)增出任何條帶(圖3)。說(shuō)明 RPB2基因的通用引物可以作為小麥腥黑粉菌的通用引物,與 TCK的特異性引物相結(jié)合可以避免PCR反應(yīng)的假陽(yáng)性及假陰性,提高 TCK分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

圖3 RPB2基因引物RPB2-740F/RPB2-1365R和TCK特異引物CQUTCK2/CQUTCK 3的PCR擴(kuò)增

3 討論

RPB2作為編碼RNA聚合酶II的第2大亞基核的基因片段,主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄[12]。到目前為止,通過(guò)對(duì)擬南芥、番茄和杜鵑的核酸雜交試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了 RPB2基因是單拷貝的[13]。研究發(fā)現(xiàn),RPB2編碼的氨基酸序列在人類、果蠅、真菌和植物間具有高度的保守性[14]。因此,RPB2基因在研究生物的系統(tǒng)發(fā)育方面具有很高的價(jià)值。目前,國(guó)外已 將 RPB2基因與 ITS[5]、RPB1[2,5]、EF[6]、β-tubulin[15]等基因片段結(jié)合對(duì)植物及真菌進(jìn)行分類及系統(tǒng)發(fā)育研究,國(guó)內(nèi)目前尚沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。

根據(jù)1999年12月2日簽署的《中美農(nóng)業(yè)合作協(xié)議》,我國(guó)對(duì)等于或低于允許量(50 g小麥樣品中3萬(wàn)個(gè)TCK孢子)的美國(guó)小麥應(yīng)不采取任何特殊措施直接進(jìn)入中國(guó)國(guó)內(nèi)任何一個(gè)地區(qū),入世后美國(guó)及其他國(guó)家TCK疫區(qū)的小麥會(huì)繼續(xù)大量出口我國(guó),隨著TCK疫區(qū)輸華小麥總量上升,隨疫麥進(jìn)口帶入的TCK冬孢子必然呈總體上升趨勢(shì),這將對(duì)我國(guó)的小麥生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅。小麥矮腥黑粉菌與其近緣種小麥光腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌在孢子形態(tài)上極為相似,僅僅依靠形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分,準(zhǔn)確性較差,而生化鑒定操作時(shí)間較長(zhǎng)[11]。尋找小麥腥黑粉菌的特異性基因片段序列,并利用其進(jìn)行系統(tǒng)分類是一種切實(shí)可行的方法。目前,一些學(xué)者對(duì)小麥矮腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌和小麥網(wǎng)腥黑粉菌的ITS[16]、IGS[17]基因片段進(jìn)行了研究,并通過(guò)對(duì)IGS區(qū)的序列分析設(shè)計(jì)出小麥光腥黑粉菌的特異引物。陳萬(wàn)權(quán)等[18]采用AFLP引物對(duì)小麥腥黑粉菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)了小麥矮腥黑粉菌的特異性分子標(biāo)記。在其他基因片段的研究方面,目前尚沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)3種小麥腥黑粉菌的RPB2基因片段的研究,分析了3種小麥腥黑粉菌在RPB2基因片段上的差異以及親緣關(guān)系,這為后續(xù)的特異性引物開(kāi)發(fā)以及黑粉菌的系統(tǒng)發(fā)育研究奠定了基礎(chǔ)。利用RPB2基因片段引物結(jié)合小麥矮腥黑粉菌的特異引物做內(nèi)置對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可作為小麥矮腥黑粉菌PCR檢測(cè)的輔助手段,以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

[1] Archambault J,Friesen J D.Genetics of eukary otic RNA polymerases I,II,and III[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1993,57(3):703-724.

[2] Wei W,Dorjbal D,Lin Y,et al.Direct interaction between the subunit RAP30 of transcription factor IIF(TFIIF)and RNA polymerase subnit 5(RPB5)which contributes to the association between TFIIF and RNA polymeraseⅡ[J].J Biol Chem,2001,276(15):12266-12273.

[3] Murakami S.Hepatitis B virus X p rotein:structure,function and biology[J].Intervirology,1999,42(2-3):81-99.

[4] Reeb V,Lutzoni F,Roux C.Contribution of RPB2 to multilocusphylogenetic studiesof the euascomycetes(Pezizomycotina,Fung)with special emphasis on the lichen-forming Acarosp oraceae and evolution of polyspory[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2004,32:1036-1060.

[5] Fr?slev T G,Matheny P B,Hibbett D S.Lower level relationships in the mushroom genus Cortinar ius(Basidiomycota,Agaricales):a comparison of RPB1,RPB2 and ITS phylogenies[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2005,37(2):602-618.

[6] Carris L M,Castlebury L A,Huang G,et a1.Tilletia vankyi,a new species of reticulate-spored bunt fungus with non-conjugating basidiospores infecting species of Festuca and Lolium[J].Mycological Research,2007,111:1386-1398.

[7] Hoffmann J A.Bunt of wheat[J].Plant Disease,1982,66:979-986.

[8] Trione E J.Dwarf bunt of wheat and its importancein international wheat trade[J].Plant Disease,1982,66(11):1083-1088.

[9] 萬(wàn)方浩.“973"項(xiàng)目“農(nóng)林危險(xiǎn)生物入侵機(jī)理與控制基礎(chǔ)研究”簡(jiǎn)介[J].昆蟲(chóng)知識(shí),2007,44(6):790-797.

[10]鄭大勇,張敏,劉太國(guó),等.小麥銹菌夏孢子DNA提取方法研究[M]∥植物保護(hù)科技創(chuàng)新與發(fā)展.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2008:507-514.

[11]年四季,殷幼平,袁青,等.小麥矮腥黑粉菌差異片段篩選與分子檢測(cè)體系的建立[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(4):725-728.

[12]Sawadogo M,Sentenac A.RNA polymerase B(II)and general transcription factors[J].Annu Rev Biochem,1990,59:711-754.

[13]Oxelman B,Bremer B.Discovery of paralogous nuclear gene sequences coding for the second-largest subunit of RNA Polymerase II(RPB2)and their phy logenetic utility in gentianales of the Asterid s[J].Molecular Biology and Evolution,2000,17(8):1131-1145.

[14]Warrilow D,Symons RH.Sequenceanalysis of the second largest subunit of tomato RNA polymerase II[J].Plant Mol Biol,1996,30:337-342.

[15]Tang A M C,Jeewon R,Hyde K D.Phylogenetic utility of protein(RPB2,β-tubulin)and ribosomal(LSU,SSU)gene sequences in the sy stematics of Sordariomycetes(Ascomycota,Fungi)[J].Antonie van Leeuwenhoek,2007,91:327-349.

[16]梁宏,張國(guó)珍,陳萬(wàn)權(quán),等.小麥矮腥黑穗病菌與其近緣種的rDNA-ITS序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào),2005,35(增刊):181-183.

[17]梁宏,彭友良,陳萬(wàn)權(quán),等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌的rDNA-IGS區(qū)的擴(kuò)增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào),2006,36(5):407-412.

[18]Chen W Q,Liu T G,Liu JH,et al.DNA marker of Tilletia controversa Kühn,a causal agent of wheat dwarf bunt[J].Czech Journal of Genetics and Plant Breeding,2006,42(Special issue):13.