胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于月季育種研究進(jìn)展

馬 策趙小慧阮 芳

(遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼寧 遼陽 111000)

月季(Rosachinensis)由于其種類繁多、花香濃郁、外觀形態(tài)多種多樣而被全世界范圍內(nèi)的各類人群所喜愛，是全球范圍內(nèi)關(guān)注度最高、最流行的鮮花之一，在園林綠化、醫(yī)藥、美容化妝、經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中具有重要的觀賞和經(jīng)濟(jì)價值。隨著人們的消費(fèi)能力的提升對新型抗病性狀優(yōu)良的月季的需求也日益劇增。但由于月季低坐果率、低種子發(fā)芽率、低成苗率以及成苗周期長，極大的制約了月季育種的快速發(fā)展。

胚培養(yǎng)技術(shù)，胚培養(yǎng)是指在體外對未成熟或成熟的胚進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)，獲得有活力植株的技術(shù)。是培育雜交后代的一個非常重要和有用的生物技術(shù)工具。自Hanning首次進(jìn)行了十字花科蘿卜屬(Raphanus)和辣根菜屬(Cochlearis)未成熟胚培養(yǎng)后，大量研究者進(jìn)行了廣泛胚培養(yǎng)研究獲得目的植株。胚培養(yǎng)技術(shù)在遠(yuǎn)緣雜交種子敗育中應(yīng)用尤為廣泛。本文綜述了胚培養(yǎng)技術(shù)在月季育種中的研究現(xiàn)狀，并對月季胚培養(yǎng)存在的問題及將來的研究進(jìn)行了展望，從而為進(jìn)一步加快月季育種研究工作奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 月季胚培養(yǎng)的類型及發(fā)育途徑

離體胚培養(yǎng)按照種子發(fā)育程度可分為未成熟胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)兩類。成熟胚培養(yǎng)又叫做自養(yǎng)期培養(yǎng)，指把發(fā)育到子葉期以后的胚從種皮中剝離，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，對月季來說大概在雜交后30～40 d后，在此時期的胚發(fā)育較為成熟，所需培養(yǎng)基成分相對簡單，胚不僅能夠滿足自身萌發(fā)和生長，還能從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)，并代謝合成其生長所需的物質(zhì)，培養(yǎng)起來較為容易。未成熟胚培養(yǎng)又稱為異養(yǎng)期培養(yǎng)，是指在胚未發(fā)育到子葉期對具胚結(jié)構(gòu)進(jìn)行離體培養(yǎng)，對于月季來說大概30 d之前，這個時期幼胚需要從周圍組織吸收營養(yǎng)物質(zhì)以滿足自身的發(fā)展。在幼胚培養(yǎng)時必須有適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，幼胚培養(yǎng)難度大(R Drewes-Alvarez，2003)。遠(yuǎn)緣雜交胚培養(yǎng)通常采用幼胚培養(yǎng)。

離體胚培養(yǎng)時，主要有以下幾種常見的途徑：①直接成苗途徑，成熟胚接種到培養(yǎng)基中，胚經(jīng)過適應(yīng)期后直接發(fā)芽形成小苗，而未成熟胚則慢慢生長增大到正常胚的大小，然后萌發(fā)成苗。作者以往研究經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成熟胚和子葉期之后未成熟胚多以直接成苗的方式產(chǎn)生帶根系完整植株。②器官發(fā)育途徑，胚培養(yǎng)時外表面形成突起的擬分生組織，然后成苗。林婭等(2007)Schum等(2003)研究發(fā)現(xiàn)以月季未成熟胚為外植體，通過生成擬分生組織在30～40 d獲得再生植株；③愈傷組織途徑，幼胚在體外培養(yǎng)時首先細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織經(jīng)激素誘導(dǎo)分化成苗，月季中胚齡較小的或剝離胚的過程中產(chǎn)生傷口的部分胚珠以這種方式成苗。如De Wit等(1990)、Rout等(1991)、ROUTGR等(1991)花 了84～126 d的時間得到再生植株。

2 影響胚培養(yǎng)效果的因素

很多因素會影響月季胚培養(yǎng)的成功，其中最主要的因素有胚的處理方法、胚齡、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等。

2.1 胚的處理方式

月季胚由于其生理性休眠和堅(jiān)硬的內(nèi)果皮，造成其種子中度休眠，從而抑制了種子的萌發(fā)。在進(jìn)行胚培養(yǎng)過程中，需要采用不同措施處理胚珠以打破種子休眠。研究發(fā)現(xiàn)胚珠處理方法有低溫冷藏、激素處理種皮、橫切、切喙、裸胚培養(yǎng)等方法。馬燕等采用赤霉素浸種和裸胚培養(yǎng)成熟胚，結(jié)果顯示帶有種皮的胚不能萌發(fā)，而去除種皮的裸胚能正常生長為植株。Marchant R等(1994)、宋杰(2011)、金菁(2010)、Serge G(1994)等研究也表明月季裸胚培養(yǎng)有利于成苗。林婭等(2007)采用胚切片(將帶種皮的胚切成3～4瓣，取里面白色呈瓣?duì)畹呐?的方法培育現(xiàn)代月季未成熟胚也獲得了正常植株。據(jù)報道，4 ℃低溫處理果實(shí)也有助于胚的萌發(fā)并提高幼胚萌發(fā)率(Serge G，1994)。而王麗花等(2008)的研究則發(fā)現(xiàn)，低溫處理并不能提高胚的萌發(fā)。推測可能與月季種類的不同有關(guān)，這還有待進(jìn)一步研究。

2.2 胚齡

由于月季基因的高度雜合且種類繁多，不同品種及雜交組合月季胚發(fā)育程度不同，合子胚的敗育程度也不同。胚齡的大小是未成熟胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，幼胚過小，胚發(fā)育不完全，胚內(nèi)營養(yǎng)積累不夠，對培養(yǎng)條件嚴(yán)苛，不易養(yǎng)活。一般來說，胚齡與出苗率呈正相關(guān)，胚發(fā)育程度越高，幼胚發(fā)芽率越高。因此，在做胚挽救時盡量選擇將要敗育但尚未敗育時接種。月季幼胚培養(yǎng)普遍認(rèn)為50～80 d最為適合(王麗花等，2008；Serge G，1994)。宋杰和金菁研究月季和薔薇遠(yuǎn)緣雜交合子胚挽救過程中發(fā)現(xiàn)30～36 d為最適胚齡，原因是在遠(yuǎn)緣雜交中大部分雜交種在25～40 d內(nèi)開始敗育，且月季雜交胚內(nèi)果皮在35 d后開始木質(zhì)化，木質(zhì)化后內(nèi)果皮堅(jiān)硬，不易破皮取出胚且易對幼胚造成傷害，在種子敗育和木質(zhì)化前進(jìn)行胚搶救是最佳時期(宋杰，2011；金菁，2010)。而Luca P等(2013)通過切片技術(shù)和不同時期胚ABA(脫落酸)含量的測定建議四倍體月季胚搶救最佳時間為15～30 d。月季易受生長環(huán)境影響，因此用花授粉后天數(shù)作胚齡的計(jì)算不太精確，有些研究者將胚發(fā)育的時期作為確定最佳接種時期的形態(tài)學(xué)指標(biāo)(Notsukaetal.，2001)，宋杰(2011)研究也發(fā)現(xiàn)處于子葉期的幼胚培養(yǎng)具有更高成活率。

2.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為胚發(fā)育提供營養(yǎng)，遠(yuǎn)緣雜交果實(shí)敗育很大原因就是不能為胚提供營養(yǎng)。因此，合適的培養(yǎng)基是胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，特別對幼胚來說。幼胚常因?yàn)榕囵B(yǎng)基不適合而產(chǎn)生非期望生長，如長成愈傷組織。而成熟胚則相反，對培養(yǎng)基要求簡單。據(jù)報道成熟胚培養(yǎng)只需提供一個濕潤且無菌的環(huán)境甚至不需要培養(yǎng)基就能萌發(fā)

(Donald，2009)。

2.3.1 基本培養(yǎng)基

月季胚培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基有成熟胚和未成熟胚培養(yǎng)基。前者主要有Tukey、AL、MS、B5等培養(yǎng)基，后者主要有Tukey、MS等培養(yǎng)基。目前，比較公認(rèn)的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。Marchant R等(1994)研究成熟胚培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，AL培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基進(jìn)行胚培養(yǎng)無顯著差別。

2.3.2 糖類

在離體胚培養(yǎng)中，一般都需要適量的糖類。加入糖一是為了維持適當(dāng)?shù)臐B透壓模擬自然生長條件，刺激胚的正常生長，二是提供所需碳源和能量。目前報道的月季胚培養(yǎng)糖類有蔗糖、葡萄糖、果糖以及麥芽糖等。但使用最多的是蔗糖，也有用別的糖的報道，Marchant R等(1994)研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖比蔗糖和麥芽糖更有利于胚的萌發(fā)，推測可能單糖更容易被胚吸收，胚內(nèi)缺乏更多相關(guān)二糖代謝合成通路。

2.3.3 激素

在培養(yǎng)中，需要加入外源激素，特別對未成熟胚來說。成熟胚培養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)積累到一定程度可自己合成生長發(fā)育所需要的激素，而未成熟胚自身合成的內(nèi)源激素不能滿足其正常的發(fā)育需要加入一定類型和比例的激素。不同植物和不同時期的胚培養(yǎng)對激素的需求很不一致。目前已報道的激素有6-BA、ZT、 Kn 、GA3、 IAA、2，4-D、BAP等，這些激素可以單一使用，也可以組合一起使用，效果不同。6-BA、GA3和NAA組合是使用最廣泛的激素。Marchant R等(1994)研究發(fā)現(xiàn)BAP對胚的萌發(fā)無顯著影響。Anuradha M等(2005)研究發(fā)現(xiàn)BA單獨(dú)使用也能促進(jìn)未成熟胚的發(fā)芽，但效果沒有與GA3共同使用好。林婭等(2007)報道ZT和NAA的共同使用可以誘導(dǎo)月季未成熟胚生成再生芽。宋杰(2011)報道6-BA、NAA和GA3共同使用能誘導(dǎo)未成熟胚的發(fā)育。

2.3.4 活性炭和維生素

活性炭因其良好的吸附性被用于組培中，其作用如下：吸附作用，吸附培養(yǎng)基中的多酚類物質(zhì)以及蔗糖在高壓滅菌時產(chǎn)生有害物質(zhì)—5-羥基糠醛，減少褐變；提供暗環(huán)境，減少由于光照造成培養(yǎng)基中激素IAA和IBA降解；促進(jìn)根的生長。宋杰和金菁在進(jìn)行月季未成熟胚培養(yǎng)時，加入了活性炭減少了胚的褐化率(宋杰，2011；金菁，2010)。維生素也一直用于離體胚培養(yǎng)中，特別是幼胚培養(yǎng)時，常用的是維生素C，主要作用是減少氧化，減少褐變，一般常與活性炭搭配使用效果比較好。

2.4 培養(yǎng)條件

2.4.1 溫度

月季胚培養(yǎng)的溫度一般為24 ℃左右。有研究表明，低溫(12±2 ℃)條件可以降低一些幼胚的褐化率且提高幼胚的出愈率，而對其萌發(fā)率無顯著影響(宋杰，2011；金菁，2010)。也有研究表明，在晝夜采用不同的溫度有利于胚培養(yǎng)。

2.4.2 光照

光照也影響胚培養(yǎng)。Anuradha M等(2005)研究月季幼胚培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，接種后14 d黑暗培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)入16 h/d光照培養(yǎng)比全光照培養(yǎng)和每天16 h/d光照培養(yǎng)胚有更高的發(fā)芽率，推測可能黑暗產(chǎn)生了更少的多酚類物質(zhì)從而促進(jìn)幼胚更好的生長，這可能是因?yàn)楹诎淡h(huán)境仿生了胚在果實(shí)中的發(fā)育。金菁發(fā)現(xiàn)在相同溫度條件下，有光照的培養(yǎng)環(huán)境比無光照的的培養(yǎng)效果好。不同植物對光質(zhì)的反應(yīng)也不同。此外，光強(qiáng)對于胚培養(yǎng)有重要影響。不同植物對光強(qiáng)的反應(yīng)也不同。

2.5 遺傳背景

無論是自交胚還是雜交胚，不同品種月季之間雜交的幼胚的萌發(fā)率和發(fā)育情況有較大差異。研究表明，月季雜交幼胚的萌發(fā)與其父母本有一定關(guān)系，王麗花等(2008)研究發(fā)現(xiàn)在相同條件下，不同組合雜交幼胚形成完整植株出苗率明顯不同，其中2個組合雜交幼胚明顯高于其他。研究發(fā)現(xiàn)月季胚珠發(fā)育受父母本品種基因型的嚴(yán)格控制。金菁研究發(fā)現(xiàn)以同一個品種‘紫香紅’為父本，不同的品種為母本，雜交幼胚的萌發(fā)率有顯著區(qū)別，而反過來以同一個品種‘白雪山’為母本，不同品種為父本，幼胚萌發(fā)率也有很大區(qū)別(金菁，2010)。根據(jù)作者以往育種經(jīng)驗(yàn)，月季后代表型受母本影響多一些，若母本結(jié)實(shí)性不好或者敗育早，雜交之后一般也表現(xiàn)為結(jié)實(shí)性不好或者敗育早。

3 胚培養(yǎng)在月季育種中的應(yīng)用

3.1 克服遠(yuǎn)緣雜種胚敗育

遠(yuǎn)緣雜交是育種中獲得新優(yōu)選植株的重要方法，通過遠(yuǎn)緣雜交，把野生型的抗病性、抗逆境性、植株長勢等優(yōu)良性狀引入新品種中，獲得性狀優(yōu)良的品種。但在遠(yuǎn)緣雜交中有很大一部分受精作用能正常完成，胚也能進(jìn)行早期的發(fā)育。但是由于兩套基因組的表達(dá)不協(xié)調(diào)，染色體核型不同(畢曉穎等，2012；劉佳，2013)，在減數(shù)分裂形成配子時分配不均，從而導(dǎo)致雜種胚和胚乳發(fā)育不完全，阻斷了水分和營養(yǎng)向胚的輸送以及由于胚與胚乳不相容導(dǎo)致的胚乳對胚胎毒害作用(Leela，2013)，造成種子的敗育或形成自然條件下不發(fā)芽種子，最終在土壤中腐爛。林毅雁、王澤翻等利用薔薇、古老月季和現(xiàn)代月季雜交發(fā)現(xiàn)雜交種子基本不萌發(fā)很難形成雜交苗(林毅雁，2010；王澤翻等，2012)。研究發(fā)現(xiàn)，不能發(fā)芽的胚也具備啟動發(fā)育的潛力，將這類不能發(fā)芽幼胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，則可以 獲 得 雜 種 植 株。Burger DW等(1990)、 Serge G等(1994)、Gudin(1994)、 Marchant R等(1994)等先后利用胚挽救方法獲得月季種間雜交后代。金菁(2010)以月季品種‘白雪山’和‘同情’做母本，古老月季紫香紅為父本進(jìn)行雜交，采用胚挽救方法獲得了遠(yuǎn)緣雜交種幼苗。宋杰(2011)以同情、白雪山、火焰舞為母本，野生薔薇金櫻子為父本通過幼胚培養(yǎng)也獲得了遠(yuǎn)緣雜交幼苗。

3.2 打破種子休眠，促進(jìn)胚萌發(fā)

月季種子屬于中度休眠類型，休眠原因主要有：內(nèi)果皮堅(jiān)硬，阻止了對水分的吸收和呼吸代謝作用；果皮和種皮內(nèi)所含ABA(脫落酸)的存在，抑制種子萌發(fā)；種胚發(fā)育不完整，必須經(jīng)過形態(tài)后熟才能萌發(fā)。月季休眠期一般為90 d，長時間的休眠拖延育種工作高效進(jìn)行。此外，月季種子發(fā)芽率非常低，據(jù)報道，一般低于20%，作者以往經(jīng)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)即使經(jīng)過低溫層積和纖維素酶的處理，種子的發(fā)芽率也不高于30%(馬策，2010)。而胚培養(yǎng)技術(shù)完全使幼胚可以跳過休眠，直接發(fā)育成幼苗，而且培養(yǎng)基中的豐富營養(yǎng)也有利于胚的生長發(fā)育 ( Lammerts，1946)。月季離體胚培養(yǎng)能在48 h后萌發(fā)，且有較高的萌發(fā)率和出苗率。Marchant R等(1994)研究發(fā)現(xiàn)離體胚培養(yǎng)比正常種植有更高的發(fā)芽率，最高能到100%。

3.3 縮短育種周期

月季植物的栽培品種一般情況下需1年才能進(jìn)入花期，而通過幼胚培養(yǎng)，幼苗只需60～90 d即可開花，極大的節(jié)約了時間。將胚培養(yǎng)得到的這種花作父本，與正常生長的母本進(jìn)行雜交，則1年內(nèi)可產(chǎn)生2個世代(Lammerts，1946；Fatih Ali CANLIetal.，2009)。使育種進(jìn)程得到極大的縮短，對育種者來說這是非常高效的。徐庭亮等(2016)以窄葉藤本月季為父母本進(jìn)行人工雜交，通過幼胚培養(yǎng)方式，從雜交授粉到獲得雜種植株的時間較常規(guī)方式縮短了109 d。

3.4 種子生活力的快速測定

運(yùn)用常規(guī)萌發(fā)試驗(yàn)測定休眠種子的生活力需要很長時間，對于月季種子來說還需要進(jìn)行后熟處理。月季種子有漫長的長達(dá)90 d的后熟期，在這個后熟期內(nèi)種子還需要進(jìn)行層積處理，對于想快速了解種子發(fā)芽情況的育種者來說，這浪費(fèi)了很多時間和精力。通過胚培養(yǎng)可以繞過種子休眠，快速進(jìn)行種子活力測定。據(jù)報道，木本植物種子的種胚在進(jìn)行離體培養(yǎng)時，是否經(jīng)過層積處理對種子萌發(fā)速率無顯著影響(Rahavan，1977)。因此，用胚培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，是快速檢測種子，尤其是檢測像月季一類需要經(jīng)過漫長休眠期種子活力的有效方法。這種方法不但能提前了解種子的萌發(fā)率，而且與染色法相比，離體胚培養(yǎng)技術(shù)檢測種子生活力結(jié)果更可靠、更精確。

3.5 用于挽救早期落果

月季經(jīng)過育種家?guī)装倌暌詠淼念l繁雜交，基因已經(jīng)高度雜合，在經(jīng)過反復(fù)雜交及選育中，選育者只關(guān)注花型花色等形態(tài)特征，而不關(guān)注其基因型和染色體倍性，造成許多月季胚珠和胚發(fā)育不良，花粉活力不高。這樣的花無論用于雜交還是自交均會造成大量落果。對于一些通過扦插等技術(shù)無法獲得植株的月季來說，胚挽救技術(shù)是十分有效的，在落果之前摘下果實(shí)，剝除種皮進(jìn)行胚培養(yǎng)，通過無菌快繁體系，很快就能獲得大量植株。

4 展望

胚培養(yǎng)技術(shù)是一項(xiàng)高效且綜合的技術(shù)，在月季新品種選育、克服遠(yuǎn)緣雜交敗育、在無休眠情況下縮短育種周期、打破種子休眠獲得高萌發(fā)率植株、提高育種效率等方面發(fā)揮著不可替代的作用。盡管它已在育種中取得了很大成績但仍然存在很多不足。如缺乏高效的用于去除內(nèi)果皮工具，目前應(yīng)用的工具主要是鉗子、解剖刀等，這些工具極大的制約了胚培養(yǎng)技術(shù)在月季育種中的的應(yīng)用；缺乏一套高效的通用的培養(yǎng)體系，不同品種的月季在對激素和培養(yǎng)條件及發(fā)育時期不同造成了每個品種均需要摸索條件，而遠(yuǎn)緣雜交果實(shí)結(jié)實(shí)率非常低，供試材料有限，限制了胚培養(yǎng)應(yīng)用；胚的發(fā)育途徑太多，經(jīng)常出現(xiàn)非期望生長，例如生成愈傷組織，沒有穩(wěn)定的成苗路徑獲得目的植株等。因此，將來我們需立足已有研究，開發(fā)一套高效穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，并通過與分子輔助育種技術(shù)、分子早期篩選技術(shù)有效結(jié)合，進(jìn)一步縮短育種周期，在有效時間內(nèi)培育出更優(yōu)質(zhì)的月季新品種。