D151樹(shù)脂一步法提取井岡霉素

鐘世華，齊風(fēng)佩，范明亮，徐滿才

(湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

井岡霉素[1]是通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的一種多組分的混合物，含量在2%左右，與日本生產(chǎn)的有效霉素(Validamycin)結(jié)構(gòu)相同[2]，其有效成分為A、B、C、D、E、F、G，其中A成分大于70%，B成分占20%左右．在pH=3.0～9.0時(shí)穩(wěn)定，能有效抑制水稻紋枯病，是國(guó)內(nèi)價(jià)格低廉、產(chǎn)量最大的生物農(nóng)藥[3]．目前提取方法多采用傳統(tǒng)方法[4]，即將發(fā)酵液預(yù)處理后直接濃縮成水劑產(chǎn)品，含量在5%左右，或者將濃縮后水劑通過(guò)真空干燥成粉劑產(chǎn)品，含量在20%左右，適合于農(nóng)用抗生素使用．鄭裕國(guó)[5]等用三步離子交換方法吸附提取井岡霉素，收率70%左右，含量達(dá)90%以上，適用于井岡霉素產(chǎn)品的后期開(kāi)發(fā)利用．作者根據(jù)井岡霉素分子結(jié)構(gòu)中仲胺基在堿性介質(zhì)中顯正電性的特點(diǎn)，提出用D151弱酸吸附樹(shù)脂一步法提取井岡霉素[6]，含量在95%左右，收率80%以上，為分離提取純化井岡霉素工藝提供有效的參考數(shù)據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與儀器

D151樹(shù)脂(南開(kāi)大學(xué)化學(xué)試劑廠)；井岡霉素發(fā)酵液(武漢科洛生物技術(shù)有限公司)；SHA-2000數(shù)顯全溫水浴振蕩器(長(zhǎng)沙素拓科學(xué)儀器設(shè)備有限公司)；BT-100B數(shù)顯恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)；BSZ-100自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；Agilent 1100液相色譜(美國(guó))．

1.2 方法

1.2.1 樹(shù)脂對(duì)不同酸度發(fā)酵液的靜態(tài)吸附 分別取25.0 mL井岡霉素發(fā)酵液(效價(jià)31 265 μg·mL-1)于6個(gè)100 mL三角瓶中，加入1.000 g D151干樹(shù)脂，分別調(diào)pH為4、5、6、7、8、9，塞好塞子，室溫振蕩24 h，取吸附后的井岡霉素發(fā)酵濾液，檢測(cè)其含量(稀釋200倍)．

1.2.2 樹(shù)脂對(duì)不同溫度發(fā)酵液的靜態(tài)吸附 分別取6個(gè)100 mL三角瓶，加25.0 mL井岡霉素發(fā)酵液(pH=8.0，效價(jià)31 265 μg·mL-1)、0.500 g D151干樹(shù)脂，塞好塞子，分別在10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 ℃水浴中振蕩24 h，取吸附后水液檢測(cè)其含量(稀釋200倍)．

1.2.3 D151樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液的動(dòng)態(tài)吸附與洗脫 采用層析柱的內(nèi)徑2.6 cm，長(zhǎng)度20 cm，床體積50 mL，預(yù)處理后的發(fā)酵液調(diào)pH = 8.0，以流速1.0、1.2、1.5、1.8、2.0 mL·min-1直接上柱，檢測(cè)流出液中井岡霉素的含量，至吸附飽和用2倍床體積流速為2.0 mL·min-1的去離子水洗，用濃度為0.5、0.8、1.0 mol·L-1氨水洗脫[5]確定恰當(dāng)濃度；在此濃度下，以流速為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL·min-1氨水洗脫．

1.2.4 D151樹(shù)脂再生與重復(fù)使用 樹(shù)脂用2 mol·L-1NaOH(aq)再生，用2 mol·L-1HCl(aq)轉(zhuǎn)型，按1.2.3方法重復(fù)使用．

1.2.5 井岡霉素效價(jià)檢測(cè) 井岡霉素效價(jià)檢測(cè)：HPLC法[7]．

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵液酸度對(duì)樹(shù)脂吸附的影響

根據(jù)1.2.1得到發(fā)酵液酸度對(duì)樹(shù)脂的吸附影響結(jié)果(見(jiàn)表1)，隨著井岡霉素發(fā)酵清液pH值的增加，其吸附量增大，當(dāng)pH值在8～9時(shí)，吸附趨于平衡；從表1中數(shù)據(jù)可以看出：D151在酸性介質(zhì)中對(duì)井岡霉素的吸附量很小，在堿性介質(zhì)中對(duì)井岡霉素的吸附量較大，且趨于平衡，這主要是由于井岡霉素分子結(jié)構(gòu)中的仲胺基在堿性介質(zhì)中顯正電性，能與D151吸附樹(shù)脂中的—COO-1形成有效結(jié)合，從而使吸附量增加．通過(guò)計(jì)算可知，在堿性介質(zhì)中D151對(duì)井岡霉素的靜態(tài)飽和吸附量為0.7 g·g-1(干樹(shù)脂)．由此發(fā)酵液應(yīng)調(diào)劑到pH=8～9時(shí)進(jìn)行樹(shù)脂吸附．

表1 發(fā)酵液酸度對(duì)吸附的影響

2.2 發(fā)酵液溫度對(duì)樹(shù)脂吸附的影響

根據(jù)1.2.2得到發(fā)酵液溫度對(duì)樹(shù)脂的吸附影響結(jié)果(見(jiàn)表2)，井岡霉素發(fā)酵液的溫度不同，D151吸附量幾乎相同，吸附量為0.7 g·g-1(干樹(shù)脂)，說(shuō)明發(fā)酵液溫度對(duì)樹(shù)脂的靜態(tài)飽和吸附影響不大．由此采用常溫發(fā)酵液進(jìn)行樹(shù)脂吸附．

表2 發(fā)酵液溫度對(duì)吸附的影響

2.3 D151樹(shù)脂對(duì)井岡霉素動(dòng)態(tài)吸附與洗脫

2.3.1 D151樹(shù)脂對(duì)井岡霉素的動(dòng)態(tài)吸附 圖1為D151樹(shù)脂對(duì)井岡霉素發(fā)酵液在不同流速下的動(dòng)態(tài)吸附曲線．從圖1中可以看出，當(dāng)流速為1.5 mL·min-1時(shí)，達(dá)到最大吸附所需的時(shí)間最短，床體積為8.5倍．當(dāng)流速減小或者增大時(shí)，都會(huì)延長(zhǎng)樹(shù)脂達(dá)到飽和吸附的時(shí)間．因此，選用流速為1.5 mL·min-1作為動(dòng)態(tài)吸附速率．

Q=流出液效價(jià)/μg·mL-1 V=流出液體積÷樹(shù)脂體積 Q=流出液效價(jià)/μg·mL-1 V=流出液體積÷樹(shù)脂體積 圖1 不同流速下的動(dòng)態(tài)吸附曲線 圖2 不同濃度洗脫劑的動(dòng)態(tài)脫附曲線

2.3.2 D151樹(shù)脂對(duì)井岡霉素的動(dòng)態(tài)脫附 圖2考察了D151樹(shù)脂吸附井岡霉素后在不同濃度氨水下脫附曲線，圖2說(shuō)明在氨水濃度為1.0 mol·L-1時(shí)洗脫所用時(shí)間最短，同時(shí)考察了在濃度為1.0 mol·L-1時(shí)不同流速下氨水洗脫劑的動(dòng)態(tài)脫附曲線，如圖3，由圖中可以看出，用1.0 mol·L-1的氨水以1.0 mL·min-1的流速洗脫時(shí)所用的時(shí)間最短，且沒(méi)有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象．

Q=流出液效價(jià)/μg·mL-1 V=流出液體積÷樹(shù)脂體積圖3 不同流速下的動(dòng)態(tài)脫附曲線 圖4 樹(shù)脂再生后在流速為1.0 mL·min-1時(shí)的動(dòng)態(tài)吸附曲線

D151樹(shù)脂對(duì)井岡霉素的動(dòng)態(tài)吸脫附實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：D151樹(shù)脂在中等流速下對(duì)井岡霉素有比較好的吸附效果，可以很快達(dá)到吸附平衡；用稀的氨水溶液可以很容易將井岡霉素洗下來(lái)，但由于井岡霉素與D151樹(shù)脂之間的結(jié)合力稍強(qiáng)，洗脫的速度就會(huì)慢一些，用1.0 mL·min-1的洗脫速度才能最快的將井岡霉素解析下來(lái)．

2.3.3 樹(shù)脂重復(fù)利用 樹(shù)脂經(jīng)過(guò)NaOH溶液再生之后，樹(shù)脂機(jī)械強(qiáng)度好，未破損．圖4是再生后的樹(shù)脂對(duì)井岡霉素的吸附曲線，從圖中可以看出，樹(shù)脂經(jīng)再生后，跟原樹(shù)脂相比對(duì)井岡霉素的吸附量有所下降，但仍可以達(dá)到85%以上的吸附率．

2.4 D151一步法吸附提取井岡霉素方法與現(xiàn)行工藝的對(duì)比分析

井岡霉素傳統(tǒng)生產(chǎn)提取方法[4]如圖5所示，發(fā)酵液預(yù)處理后，經(jīng)減壓濃縮，得水劑產(chǎn)品含量在5%～10%，呈醬油狀，作為農(nóng)用抗生素雖不影響使用效果，但由于含量低，浪費(fèi)了大量包裝材料和運(yùn)輸費(fèi)用；10%的水劑產(chǎn)品經(jīng)真空干燥得粉劑產(chǎn)品，含量在20%左右，粉碎時(shí)粉塵多，且極易吸潮成膏狀，影響產(chǎn)品的溶解度，直接影響藥物的噴灑和使用效果；產(chǎn)品收率在80%左右．

圖5 傳統(tǒng)提取工藝流程

隨著井岡霉素下游產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用，對(duì)井岡霉素產(chǎn)品的質(zhì)量提出了更高的要求，1996年鄭裕國(guó)等報(bào)道了使用凝膠離子交換樹(shù)脂來(lái)提取分離發(fā)酵液中井岡霉素，具體方法如圖6所示．發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后，先用堿性陰離子交換樹(shù)脂除去陰離子雜質(zhì)；后用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂除去陽(yáng)離子雜質(zhì)；再用001×4強(qiáng)酸凝膠樹(shù)脂吸附井岡霉素，去離子水洗；氨水解吸，收集解脫液經(jīng)減壓濃縮、活性炭脫色、干燥，得到了高純度的井岡霉素產(chǎn)品，產(chǎn)品收率在70%左右，目前已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化．

圖6 離子交換法提取工藝流程

在井岡霉素下游產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用方面，申屠旭萍、鄭裕國(guó)[8]等用微生物酶解的方法，裂解井岡霉素的C—N鍵，產(chǎn)生井岡霉烯胺，再通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)井岡霉醇胺，井岡霉醇胺是合成伏格列波糖(新一代降糖藥)的關(guān)鍵中間體．張憲鋒、鄭裕國(guó)、沈寅初[9]等用微生物轉(zhuǎn)化法裂解井岡霉素生產(chǎn)井岡霉亞基胺A，制備了一種生物殺蟲(chóng)劑．這些都需要高純度的井岡霉素產(chǎn)品來(lái)支持．由于現(xiàn)行離子交換法吸附提取工藝存在流程長(zhǎng)、廢水排放量大、凝膠樹(shù)脂吸附量相對(duì)較低、收率低、成本高等問(wèn)題．作者根據(jù)井岡霉素分子結(jié)構(gòu)中仲胺基在堿性介質(zhì)中顯電正性的特點(diǎn)，采用一步法吸附提取井岡霉素，如圖7所示，即將發(fā)酵液調(diào)pH = 8～9，采用大孔交聯(lián)D151樹(shù)脂吸附，去離子水洗至中性，氨水解脫，解脫液減壓濃縮至10波美(減壓濃縮時(shí)除去的氨氣可用樹(shù)脂再生的鹽酸溶液吸收)，活性炭脫色，濾液減壓濃縮至16波美，真空干燥得白色粉末．井岡霉素含量在95%左右，收得率80%以上．

圖7 D151吸附樹(shù)脂提取工藝流程

3 結(jié)論

井岡霉素發(fā)酵液調(diào)pH=8.0左右，在常溫下采用D151樹(shù)脂一步法吸附提取，縮短了樹(shù)脂提取流程，減少了廢水的排放量；采用樹(shù)脂再生的鹽酸溶液吸收減壓濃縮除去的氨氣，能減少氨氣的直接排放．大孔交聯(lián)D151樹(shù)脂對(duì)井岡霉素吸附量大(0.7 g·g-1干樹(shù)脂)，選擇性高，氨水解脫快，提取所得井岡霉素產(chǎn)品質(zhì)量高(含量在95%)．

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