尿素、氯化銨、碳酸銨對牛奶樣品微量凱氏定氮法的干擾

袁炳秋，呂 媛，馬 鈺，戴玉明，劉彩云，曾 林，易銀沙*

(1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410081； 2. 長沙贏潤生物技術(shù)有限公司,中國 長沙 410013)

凱氏定氮法的普遍適用性、精確性和可重復(fù)性已經(jīng)得到了國際的廣泛認可[1]．它已經(jīng)被確定為檢測食品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]．目前，牛奶中蛋白含量的測定主要采用國標(biāo)法凱氏定氮法[3]，該方法基于測定含氮量來間接測定蛋白質(zhì)含量，它與所測樣品的蛋白質(zhì)組成無關(guān)，不受樣品顏色的影響，是美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)推薦的測定蛋白的方法[4]．但是，這種方法并不能給出真實的蛋白質(zhì)含量，因為凱氏定氮法所測定的氮可能不僅僅是由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化來的，它也可以是其他非蛋白質(zhì)物質(zhì)所轉(zhuǎn)化的[5]，因此有些人便利用凱氏定氮法這一缺陷往牛奶中加入各種非蛋白氮來干擾凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量，達到以假亂真以次充好的目的．近年來，國內(nèi)外多次發(fā)生牛奶摻假事件．特別是2008年我國發(fā)生了國產(chǎn)奶粉中大規(guī)模地檢測出三聚氰銨的毒奶粉事件,這一以非蛋白(三聚氰銨)充當(dāng)?shù)鞍椎膿郊傩袨槭谷藗兊慕】凳艿絿?yán)重影響,也顯現(xiàn)出了傳統(tǒng)的牛奶蛋白定量檢測方法(凱氏定氮法)的種種缺陷和不足．為了進一步探索非蛋白氮對凱氏定氮法的影響程度，本實驗特意對尿素、氯化銨、碳酸銨3種含氮物質(zhì)對凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量的干擾進行專門的研究和探討．

目前，國內(nèi)外對凱氏定氮法的研究比較多，對凱氏定氮法測定食物蛋白時的干擾因素也比較關(guān)注[6-10]，但大多集中在通過改良凱氏定氮法[11-13]和用其他蛋白質(zhì)測定方法代替凱氏定氮法從而避免干擾物質(zhì)對凱氏定氮法的影響這兩方面．例如主張用紅外技術(shù)[14]代替凱氏定氮法或用三氯乙酸[15]處理樣品，讓真正的蛋白質(zhì)形成沉淀，過濾后，分別測定沉淀和濾液中的氮含量，從而測定蛋白質(zhì)的真正含量和冒充蛋白質(zhì)的氮含量．而事實上對凱氏定氮法測定食物蛋白時的干擾因素的深入研究很少，目前尚未見到針對尿素、氯化銨、碳酸銨等含氮物質(zhì)在凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量時的干擾程度，在本實驗之前，非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)已被確認為凱氏定氮法測定食物蛋白含量的干擾因素，因此本文的研究著重探討尿素、氯化銨、碳酸銨含氮物質(zhì)對凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量具有明顯的干擾作用及干擾作用的強度．

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計：2 100 pro 型(北京瑞利分析儀器公司)、微量凱氏定氮儀．

所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制． 硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、40 g/L硼酸吸收液(20 g硼酸溶解于500 mL熱蒸餾水中)、過氧化氫溶液(體積分數(shù)為30% ),氫氧化鈉溶液(質(zhì)量比為400/1 000；稱取400 g氫氧化鈉，用1 000 mL水溶解，待冷卻后移入試劑瓶中)、甲基紅一漠甲酚綠混合指示劑(用體積分數(shù)為95%的乙醇將澳甲酚綠及甲基紅分別配成1 g/L的乙醇溶液，使用時按1 g/L澳甲酚綠與1 g/L甲基紅的體積比為5∶1的比例混合)、0.1 mo1/L硫酸(或鹽酸)標(biāo)準(zhǔn)溶液．

牛奶樣品溶液:來源當(dāng)?shù)爻械囊晾?50 mL純牛奶(批號：D10209E1203)

1.2 實驗方法

1.2.1 牛奶稀釋樣品及尿素等干擾樣品的配制 取0.1 mL牛奶原品，用二次蒸餾水定容到5 mL，得50倍稀釋樣品，從5 mL的50倍稀釋樣品中取2.5 mL再次定容到5 mL，得100倍稀釋樣品．從100倍牛奶稀釋樣品中各取0.1 mL于6管試管中，分別加入干擾品(尿素或氯化銨或碳酸銨)配制成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mol的干擾品．

1.2.2 牛奶稀釋樣品中蛋白濃度的測定 用微量凱氏定氮儀測定50倍、100倍牛奶稀釋樣品中的蛋白含量，分別取1 mL的50倍、100倍牛奶稀釋樣品于8管消化管中,蒸發(fā)至干．然后依次向各消化管中加入硫酸銅與硫酸鉀(體積比為4∶100)的混合200 mg、硫酸5 mL及數(shù)粒玻璃珠至于電爐上緩慢加熱消化，注意防止溶液沸騰．再將消化液用定氮儀蒸餾，蒸餾步驟為:在各消化液中加入適量的30%NaOH溶液開始蒸餾(用蒸餾水做空白液),反應(yīng)出來的氨用硼酸溶液吸收,蒸餾液用0.01 mol/L的鹽酸滴定(采用微量滴定管) ，計算出含氮量．將含氮量乘以6.25換算成蛋白質(zhì)的含量．

1.2.3 牛奶干擾樣品中蛋白濃度的測定 方法同牛奶稀釋樣品中蛋白濃度的測定．分別測定加入不同種類和濃度干擾物后(尿素/氯化銨/碳酸銨)，50倍、100倍稀釋牛奶的蛋白濃度．

1.2.4 微量凱氏定氮法的測定步驟 分別取1 mL 的50倍、100倍牛奶稀釋樣品和不同尿素濃度的干擾樣品于8管消化管中，蒸發(fā)至干．然后依次向各消化管中加入硫酸銅與硫酸鉀(體積比為4∶100)的混合物200 mg、硫酸5 mL及數(shù)粒玻璃珠置于電爐上緩慢加熱消化，注意防止溶液沸騰．再將消化液用定氮儀蒸餾，蒸餾步驟為：在各消化液中加入適量的30%NaOH溶液開始蒸餾(用蒸餾水做空白液)，反應(yīng)出來的氨用硼酸溶液吸收，蒸餾液用0.01 mol/L的鹽酸滴定(采用微量滴定管) ，計算出含氮量．將含氮量乘以6.25換算成蛋白質(zhì)的含量．

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶稀釋樣品中蛋白濃度的測定

用微量凱氏定氮法測定50倍、100倍稀釋樣品的濃度．測定結(jié)果見表1．根據(jù)表1中微量凱氏定氮法測定的50倍牛奶稀釋樣品的蛋白含量數(shù)據(jù)，計算出6個50倍牛奶稀釋樣品平均值=801.7 ug/mL，標(biāo)準(zhǔn)差=7.32 ug/mL，CV(變異系數(shù))=0.91%．同理，根據(jù)微量凱氏定氮法測定的100倍牛奶稀釋樣品的數(shù)據(jù)，計算出平均值=377.5 ug/mL，標(biāo)準(zhǔn)差=3.86 ug/mL，CV(變異系數(shù))=1.02%，由此可見，在沒有任何干擾物質(zhì)存在的條件下，用微量凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量，重現(xiàn)性較好，變異程度較小，精密度較高．

表1 微量凱氏定氮法測定牛奶稀釋樣品結(jié)果

2.2 牛奶干擾樣品中蛋白濃度的測定

用微量凱氏定氮法分別測定加入不同干擾物(尿素/氯化銨/碳酸銨)的1 mL 50倍、100倍稀釋牛奶的蛋白含量，結(jié)果分別見表2～4．

以原各稀釋樣品中測得的蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表2中微量凱氏定氮法測定的加入尿素干擾物的50倍牛奶蛋白含量數(shù)據(jù)，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，分別為3.09、4.98、6.56、9.28、11.55、14.4，均大于2%；同理，根據(jù)微量凱氏定氮法測定的加入尿素干擾物的100倍牛奶稀釋樣品蛋白含量數(shù)據(jù)，計算其RSD分別為2.73、5.62、7.60、13.06、21.48、31.95，均大于2%，由此可見，在加入尿素時，用微量凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量，其結(jié)果明顯受到干擾，精密度差．

以原各稀釋樣品中的測得的蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表3中微量凱氏定氮法測定的加入氯化銨干擾物的50倍牛奶稀釋樣品蛋白含量數(shù)據(jù)，計算RSD分別為2.22、2.68、4.07、7.20、9.33、11.6，均大于2%；同理，根據(jù)微量凱氏定氮法測定的加入干氯化銨干擾物的100倍牛奶稀釋樣品蛋白含量數(shù)據(jù)，計算其RSD分別為2.62、5.62、7.34、13.83、20.92、33.40，均大于2%，由此可見，在氯化銨干擾物存在的條件下，明顯影響微量凱氏定氮法測定牛奶蛋白含濃度的準(zhǔn)確性，精密度也差．

根據(jù)表4中微量凱氏定氮法測定的加入碳酸銨干擾物的50倍牛奶稀釋樣品蛋白含量數(shù)據(jù)，計算得出RSD分別為2.54、 3.83、 5.48、 7.80、 10.37、 12.80，均大于2%；同理，根據(jù)微量凱氏定氮法測定的加入碳酸銨干擾物的100倍牛奶稀釋樣品蛋白含量數(shù)據(jù)，計算其RSD分別3.18、 6.41、 9.22、 15.52、 21.11、 29.46，也均大于2%，由此可見，在碳酸銨存在的干擾物條件下，用微量凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量準(zhǔn)確性不好．

表2 微量凱氏定氮法測定尿素干擾樣品結(jié)果

表3 微量凱氏定氮法測定氯化銨干擾樣品結(jié)果

表4 微量凱氏定氮法測定碳酸銨干擾樣品結(jié)果

2.3 微量凱氏定氮法測定牛奶稀釋樣品中蛋白濃度與干擾樣品蛋白濃度比較

在表5～7的比較中，加入各濃度的不同種類干擾物質(zhì)前后，相對誤差隨干擾物的濃度增加而不斷增大；其中，100倍稀釋牛奶樣品的相對誤差均在4.06%～32.05%，50倍稀釋牛奶樣品相對誤差范圍在0.99%～14.46%，顯著小于100倍稀釋樣品的相對誤差；其次，從表5～7的比較結(jié)果可以看出，在加入稀釋牛奶樣品的3種干擾物中，加入尿素的一組相對誤差最大，加入氯化銨的一組相對誤差相比最小，加入碳酸銨的一組相對誤差居中．

表5 微量凱氏定氮法測定牛奶稀釋樣品與尿素干擾樣品比較

表6 微量凱氏定氮法測定牛奶稀釋樣品與氯化銨干擾樣品比較

表7 微量凱氏定氮法測定牛奶稀釋樣品與碳酸銨干擾樣品比較

3 討論

微量凱氏定氮法的精確性和可重復(fù)性已經(jīng)得到了國際的普遍認可，被廣泛用于檢測食品中蛋白質(zhì)含量．本試驗首先使用凱氏定氮法分別測定牛奶樣品的不同濃度稀釋品中的蛋白濃度，表1的結(jié)果顯示50倍和100倍稀釋樣品中蛋白質(zhì)濃度的變異系數(shù)分別為0.91%、1.02%，表明微量凱氏定氮法在測定牛奶樣品中的蛋白含量穩(wěn)定性好．在測定加入不同干擾物(尿素/氯化銨/碳酸銨)的50倍、100倍稀釋牛奶的蛋白含量時，由表2、表3、表4結(jié)果顯示其相對平均偏差均大于1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于2%，表明微量凱氏定氮法在測定加入不同干擾物的50倍、100倍稀釋牛奶的蛋白含量時，重現(xiàn)性差，精密度也差，并且所測定的加入干擾物質(zhì)的100倍稀釋比50倍稀釋牛奶牛奶的蛋白含量的準(zhǔn)確性要差，這可能是因為相同量的干擾物質(zhì)對相對稀釋牛奶樣品的蛋白含量影響更明顯，因為相同量的干擾物質(zhì)在相對稀釋牛奶樣品中相對較多，所占的分量較大．另外，凱式定氮法得到的尿素干擾牛奶樣品中蛋白含量最高且誤差最大的這一現(xiàn)象，這可能和加入牛奶樣品中的不同干擾物的含氮量相關(guān)，尿素的含氮量為46.7%，碳酸銨含氮量為29.2%,氯化銨含氮量為26.2%，尿素中含量相對較高的非蛋白氮對微量凱氏定氮法的干擾也最明顯，以至在加入稀釋牛奶樣品的3種干擾物中，加入尿素的一組相對誤差最大．本實驗在加入稀釋牛奶樣品的同一種干擾物中，隨著加入的干擾物的量逐漸增加，干擾物對微量凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量的干擾越明顯，產(chǎn)生的相對誤差也逐漸增大．例如在表5中，隨著加入尿素干擾物的量逐漸增加，兩種不同稀釋度樣品的相對誤差分別從1.86%增加到14.46%，從4.16%增加到32.05%．總之，干擾物質(zhì)中的非蛋白氮對微量凱氏定氮法測定牛奶蛋白含量有干擾，非蛋白氮含量越多，干擾越明顯．

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