增殖誘導(dǎo)配體和受體在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

于 杰，龔治林 (長江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 荊州 434020)

增殖誘導(dǎo)配體和受體在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

于 杰，龔治林
(長江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 荊州 434020)

目的：觀察增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)及其受體在大腸癌的表達(dá)，并探討其臨床意義。方法：應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測大腸癌40份、12份潰瘍性結(jié)腸炎、12份腸克羅恩病、12份管狀腺瘤、12份家族腺瘤性息肉、12份正常大腸粘膜中APRIL及其受體的表達(dá)，并分析其臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：顯示在管狀腺瘤、家族性腺瘤性息肉和大腸癌組織中APRIL及受體HSPG表達(dá)水平顯著高于正常對照組、潰瘍性結(jié)腸炎和腸克羅恩病(P<0.05)，在大腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于管狀腺瘤和家族性腺瘤性息肉(P<0.05)。結(jié)論：APRIL在大腸癌的病變演進(jìn)過程中呈現(xiàn)累積和漸進(jìn)趨勢。

大腸癌；增值誘導(dǎo)配體；受體

在世界范圍內(nèi)，大腸癌年發(fā)病近120萬例，發(fā)病率在男性惡性腫瘤中排第4位，在女性惡性腫瘤中排第3位[1]。據(jù)美國癌癥學(xué)會估計，2009年美國有146970例大腸癌新發(fā)患者，并有49920例患者死于大腸癌[2]。在我國，2002年大腸癌年齡標(biāo)化發(fā)病率為男性13.6/10萬人，女性9.2/10萬人[3]。研究顯示，早中期大腸癌術(shù)后5年生存率高達(dá)90%以上，甚至可以長期生存，而晚期大腸癌術(shù)后5年生存率僅為50%左右，如術(shù)后出現(xiàn)吻合口漏等并發(fā)癥，其術(shù)后5年生存率僅30%左右[4]，因此早期發(fā)現(xiàn)大腸癌非常重要。

增殖誘導(dǎo)配體(a proliferation-inducing ligand，APRIL)是腫瘤壞死因子tumor necrosis factor，TNF) 超家族的新成員，可在多種消化道腫瘤中表達(dá)，因此有望作為一種腫瘤標(biāo)志物通過非侵入性來診斷大腸癌。我們熒光RT-PCR法檢測APRIL和它的三個受體TACI、BCMA、HSPG在大腸癌發(fā)生各階段組織中的表達(dá)情況，探討其在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系，旨在為大腸癌的早期診斷和尋找抗癌治療的靶分子提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1對象100例患者大腸標(biāo)本中，其中大腸癌40例為我院胃腸外科手術(shù)切除標(biāo)本，其余60份為荊州市中心醫(yī)院內(nèi)鏡中心內(nèi)鏡下活檢組織，正常大腸粘膜、潰瘍性結(jié)腸炎、腸克羅恩病、管狀腺瘤、家族性腺瘤性息肉各12例。所有患者取材前未受過放、化療或生物治療等干預(yù)治療。所有標(biāo)本組織手術(shù)切除后于30min內(nèi)迅速放入液氮，后移至-80℃冰箱凍存，并術(shù)后經(jīng)病理學(xué)鑒定證實。

1.2方法

1.2.1 主要試劑 Trizol試劑 (上海生工生物工程公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (上海奇康生物科技有限公司)；0.5ml dNTP；10×PCR 緩沖液；DiamondTM 250bp DNA Marker；1000U DiamondTM Taq DNA Polymerase ；DEPC；瓊脂糖(均購自上海生工生物工程公司)；其他：75%乙醇(RNase free)、氯仿、異丙醇、TAE電泳緩沖液、6×上樣緩沖液等。APRIL、TACI、BCMA、HSPG和β2微球蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)品 (上海奇康生物科技有限公司)。

1.2.2實驗設(shè)備 DY-501 B型電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)，THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設(shè)備廠)，AllegraTM 64R臺式高速離心機(jī)(美國Backman-Coulter 公司)，U-00800 200V DioE ARRAY BIO PHOTOME核酸紫外檢測儀(日本HITACHI公司)，Dolphin-Doc凝膠成像系統(tǒng)(美國WEAITEC公司)LightCycler熒光PCR儀及軟件系統(tǒng)(美國羅氏公司)

1.2.3 引物設(shè)計及合成 應(yīng)用primer premer5.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計APRIL、TACI、BCMA、HSPG、內(nèi)參照基因β2M的引物，由上海生工生物工程公司合成。引物長度分別為APRIL(150bp)、TACI(113bp)、BCMA(142bp)、HSPG(224bp)、β2M(100bp)。

1.2.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) Trizol法提取組織總RNA，核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA質(zhì)量和濃度。將逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從-20℃冰箱取出后室溫融化。取0.2ml的離心管依次加入模板RNA 0.1～5μg，引物Oligo(dT)18(0.5μg/μl) 1μl，DEPC水至12μl，將試管移至PCR儀中用Instant Incubate 程序70℃孵育5min，冰上冷卻至少1min后離心片刻。再按以下順序加入其余試劑5×Reaction buffer 4μl，Ribonuclease inhibitor(20U/μl) 1μl，10mmol/L dNTP mix 2μl，升至70℃，10min以終止反應(yīng)，隨后冰上冷卻，將反應(yīng)生成的cDNA分裝，并放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5AP RI L及其受體mRNA含量測定 冰上在0.5ml PCR管內(nèi)依次加入：10×PCR 緩沖液 2.5μl，25mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/μl目的基因上游引物 0.5μl，10pmol/μl目的基因下游引物 0.5μl，10pmol/μl β2上游引物1.0μl，10pmol/μl β2下游引物1.0μl，cDNA模板 1.0μl，1U/μlTaq DNA聚合酶 0.2μl?；靹蚝蠹尤隦oche專用毛細(xì)管中各反應(yīng) 管于Roche熒光定量檢測儀(Lighcycler) 進(jìn) 行 PCR擴(kuò)增，94℃，3min，預(yù)變性；94℃，30s→54℃，30s→72℃，50s共30個循環(huán)。根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，軟件自動計算 出待測樣本中靶基因或p M mR NA的準(zhǔn)確含量。

2 結(jié) 果

2.1組織總RNA純度與完整性鑒定電泳結(jié)果觀察到28、18s兩條清晰的條帶，紫外分光光度計檢測260/280nm的值在1.7～2.2之間才用于進(jìn)行cDNA合成。

2.2APRIL及其受體的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性鑒定APRIL(150bp)、 BCMA (142bp) 、TACI (113bp)、和 HSPG (224bp)擴(kuò)增片段經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段長度與理論大小一致。

2.3APRIL及受體PCR批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測見表1。

表1 APRIL及受體PCR批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測結(jié)果

2.4APRIL及其受體mRNA的RFQ-PCR檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，在管狀腺瘤、家族性腺瘤性息肉生和大腸癌組織中APRIL及受體HSPG表達(dá)水平顯著高于正常對照組、潰瘍性結(jié)腸炎和腸克羅恩病(P<0.05)，在大腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于管狀腺瘤和家族性腺瘤性息肉(P<0.05)。APRIL在大腸癌的病變演進(jìn)過程中呈現(xiàn)累積和漸進(jìn)趨勢。

表2 大腸癌及對照組織中APRIL及其受體mRNA的水平

注：與正常對照組、潰瘍性結(jié)腸炎組和腸克羅恩病組相比，*P<0.05；與管狀腺瘤組相比，#P<0.05；與家族性腺瘤性息肉組相比，△P<0.05。

3 討 論

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在西方發(fā)達(dá)國家其發(fā)病率居惡性腫瘤譜的第二位。隨著人們生活水平的提高、飲食習(xí)慣的改變，我國大腸癌的發(fā)病率也日漸增高，已躍居第3～5位。上世紀(jì)90年代與70年代相比，我國大腸癌的發(fā)病率在城市上升了31.95%，在農(nóng)村上升了8.51%[5]。

大腸癌不同于其他腫瘤，它一般先由正常粘膜上皮轉(zhuǎn)變成腺瘤再變成腺癌的過程，很少有一開始就表現(xiàn)惡性的情況。如果能在大腸癌發(fā)生前通過對某些分子的檢測達(dá)到對其的預(yù)警或預(yù)測，使其早期能確診，這對降低大腸癌的發(fā)病率或提套臨床治愈率有重要意義，但目前仍無單一的分子檢測能進(jìn)行早期預(yù)警。

增值誘導(dǎo)配體(APRIL)亦稱為TAIL-2、TRDL-1和TNASF-13a，1998年首先由 Ha h n e等[6-7]發(fā)現(xiàn)并克隆成功。研究發(fā)現(xiàn)，APRIL主要通過靶細(xì)胞表面的2個受體[穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interaor，TAC)和B細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA) ] 結(jié)合， 從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)體液免疫，并參與B、T淋巴細(xì)胞增殖和活化。人BCMA由TNFRS F17編碼，由185個氨基酸組成，胞外區(qū)具有50個氨基酸，包括1個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)，主要分布在活化的B淋巴細(xì)胞中，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系亦高表達(dá)，人TACI由TNFRSF13B編碼，定位于17p11.2，由293個氨基酸組成，胞外含有2個CRD，主要分布于B淋巴細(xì)胞和活化的T細(xì)胞表面。人HSPG基因位于1p36.1，根據(jù)不同的核心蛋白和葡胺聚糖鏈HSPG包括大約10余種不同的蛋白聚糖，在哺乳動物主要表達(dá)在細(xì)胞表面或存在于細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中[8-13]。

我們通過熒光RT-PCR方法測定了APRIL及其受體mRNA在正常大腸粘膜、潰瘍性結(jié)腸炎、腸克羅恩病、管狀腺瘤、家族性腺瘤性息肉及大腸癌中的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APRIL在管狀腺瘤、家族腺瘤性息肉及大腸癌中的含量顯著高于正常大腸粘膜、潰瘍性結(jié)腸炎及腸克羅恩病(P<0.05)，另外APRIL在大腸癌中的含量顯著高于管狀腺瘤及家族腺瘤性息肉(P<0.05)，而正常大腸粘膜、潰瘍性結(jié)腸炎、腸克羅恩病之間及管狀腺瘤、家族腺瘤性息肉之間APRIL無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。以上結(jié)果顯示APRIL在結(jié)直腸癌的病變、演進(jìn)過程中呈現(xiàn)累積和漸進(jìn)趨勢，提示APRIL在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起了重要作用，而且有可能成為結(jié)直腸癌早期診斷和抗癌治療的靶分子。

總之，通過本研究初步探討了APRIL在大腸癌的不同階段的含量，為以后進(jìn)一步研究及抗癌藥物的研制提供了一個實驗基礎(chǔ)。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.009

R735.3

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1673-1409(2010)03-R020-03