肝細(xì)胞癌中Runx3基因表達(dá)狀態(tài)分析及預(yù)后評(píng)估價(jià)值的研究

張海元，熊 維，任松森 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

肝細(xì)胞癌中Runx3基因表達(dá)狀態(tài)分析及預(yù)后評(píng)估價(jià)值的研究

張海元，熊 維，任松森
(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探討肝細(xì)胞癌組織中Runx3基因的表達(dá)及其與肝細(xì)胞癌臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。方法：采用免疫組化SP法檢測(cè)RUNX3蛋白在52例肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織及其癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果：在肝細(xì)胞癌組織中，RUNX3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率僅為34.6%，明顯低于癌旁正常組織(92.3%)中的表達(dá)率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌有無(wú)侵潤(rùn)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，而與病人的年齡、腫瘤類型等無(wú)關(guān)；術(shù)后隨訪顯示，RUNX3蛋白表達(dá)陽(yáng)性者的生存率高于表達(dá)陰性者 (P<0.05)。結(jié)論：從肝細(xì)胞癌中RUNX3蛋白表達(dá)明顯降低，且RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌有無(wú)侵潤(rùn)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，說(shuō)明Runx3基因的功能失活與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；RUNX3蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)狀態(tài)對(duì)評(píng)價(jià)該病患者的預(yù)后具有一定的價(jià)值。

Runx3基因；肝細(xì)胞癌；預(yù)后

人類Runx3基因位于1號(hào)染色體的1p36.1[1],基因全長(zhǎng)約67kb,含有p1和p2兩個(gè)啟動(dòng)子、6個(gè)外顯子和1290kb的開放閱讀框，其表達(dá)產(chǎn)物約由415個(gè)氨基酸殘基組成，RUNX3蛋白在TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化與凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。據(jù)Song等[3]報(bào)道，原發(fā)性肝癌存在著嚴(yán)重的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,這說(shuō)明Runx3基因可能在肝細(xì)胞肝癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是關(guān)鍵性的腫瘤抑制基因，其功能失活可導(dǎo)致TGF-β/SMADS信號(hào)通路削弱。筆者主要采免疫組化的方法檢測(cè)Runx3基因在肝細(xì)胞癌和癌旁正常肝組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，結(jié)合隨訪資料探討Runx3基因表達(dá)與患者的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料收集湖北省腫瘤醫(yī)院、鄂州市中心醫(yī)院病理科2005至2006年肝細(xì)胞癌患者肝臟手術(shù)標(biāo)本52例。肝細(xì)胞癌標(biāo)本都具有完整的隨訪資料，患者年齡32～84歲，平均年齡53.2歲。其中男43例，女9例，所選取的肝細(xì)胞癌患者術(shù)前均未實(shí)施放療或化療。所取組織離體后立即一分為二，一份先置于液氮中速凍10min,然后置于-80℃冰箱中保存。另一份以40g/L甲醛溶液固定，制作常規(guī)病理切片，通過(guò)HE染色，確定病理診斷。

1.2方法

1.2.1 RUNX3蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SP法，檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織中RUNX3蛋白，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。濃縮型RUNX3兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Active Motif公司，羊抗兔二抗等及DAB試劑均購(gòu)自福州邁新公司。采用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。UNX3蛋白在肝細(xì)胞癌、癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核陽(yáng)性，呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%為陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜染色為陰性[4]。

1.2.2隨訪方法 采用寫信、發(fā)郵件、打電話等方法進(jìn)行隨訪，內(nèi)容包括：患者存活狀態(tài)、腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0軟件對(duì)RUNX3蛋白表達(dá)率進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1RUNX3蛋白在肝細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)RUNX3陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒分布。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析表明，肝細(xì)胞癌中RUNX3表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 RUNX3蛋白在肝細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá) 例(%)

注：兩種組織Runx3表達(dá)陽(yáng)性率比較，P<0.05。

2.2RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系對(duì)RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析(見表2)，發(fā)現(xiàn)RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌有無(wú)侵潤(rùn)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。在微血管受侵的27例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中，僅有7例患者表達(dá)RUNX3蛋白，RUNX3陽(yáng)性率僅為25.8%，明顯低于25例微血管未受侵的肝細(xì)胞癌患者的RUNX3陽(yáng)性率(64.0%)，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者RUNX3陽(yáng)性率(20.0%)和Ⅲ ～Ⅳ期患者陽(yáng)性率(19.0%)顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(50.0%)和Ⅰ～Ⅱ期患者(45.1%)。此外,RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者年齡、性別、是否攜帶病毒及腫瘤大小等臨床病理參數(shù)無(wú)相關(guān)性。

表2 肝細(xì)胞癌組織Runx3基因表達(dá) 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

2.3RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者隨訪結(jié)果之間的關(guān)系對(duì)本研究中的肝細(xì)胞癌患者隨訪3年，存活20例，死亡32例。在RUNX3陽(yáng)性表達(dá)的18例肝細(xì)胞癌患者中，存活13例，死亡5例，存活率為72.2%；而RUNX3陰性表達(dá)的34例患者中，存活7例，死亡27例，存活率僅為20.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

肝細(xì)胞癌是一種常見的消化道腫瘤，在我國(guó)肝細(xì)胞癌的發(fā)病率僅次于胃癌和食道癌。肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段相互作用的級(jí)聯(lián)結(jié)果，涉及到多種基因的異常改變，其中腫瘤抑制基因失活與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Runx3基因是哺乳動(dòng)物中Runx家族的進(jìn)化基礎(chǔ),為新近克隆的一種候選抑癌基因[5]，是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，被激活的Smad復(fù)合物需在RUNX蛋白(包括RUNX3)的指導(dǎo)下,方能從胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)入核內(nèi)特定靶位點(diǎn)，并加強(qiáng)Smad復(fù)合物與靶位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度[6]。研究提示Runx3基因可能是TGF-β信號(hào)作用的靶點(diǎn)[7]，作為TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)，參與TGF-β對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控作用。許多研究表明，Runx3基因在胃癌、結(jié)腸癌、膽道腫瘤、肺癌、嬰兒睪丸內(nèi)胚竇瘤等人類多種腫瘤中存在啟動(dòng)子區(qū)域甲基化異常[1,8-12]，在肝癌中也有報(bào)道[13-14]，這可能是抑癌基因Runx3失活的主要機(jī)制。

筆者檢測(cè)了RUNX3蛋白在肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織中RUNX3表達(dá)明顯下降，提示Runx3基因失活可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生相關(guān)。據(jù)報(bào)道[15]，在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，轉(zhuǎn)錄因子RUNX3蛋白如位于細(xì)胞質(zhì)中被認(rèn)為是一種無(wú)活性、無(wú)功能的狀態(tài)，只有當(dāng)RUNX3蛋白遷入細(xì)胞核中并轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)時(shí)，才能在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抗癌作用。在本研究的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)癌旁正常組織RUNX3陽(yáng)性表達(dá)部位全部位于細(xì)胞核，而肝細(xì)胞癌中有部分病例出現(xiàn)明顯的細(xì)胞質(zhì)著色，而細(xì)胞核不著色。因此提示在肝細(xì)胞癌中，RUNX3蛋白通常處于失活狀態(tài)，并可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究表明，RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌是否侵潤(rùn)有關(guān)，即在微血管受侵的肝細(xì)胞癌患者中RUNX3蛋白表達(dá)明顯低于無(wú)侵潤(rùn)性肝細(xì)胞癌的表達(dá)。RUNX3蛋白表達(dá)也與肝細(xì)胞癌臨床分期密切相關(guān)，隨著肝細(xì)胞癌病情進(jìn)展，RUNX3蛋白明顯降低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌患者RUNX3蛋白表達(dá)較未轉(zhuǎn)移患者明顯降低。由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝細(xì)胞癌臨床分期直接關(guān)系著肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后，因此提示RUNX3蛋白表達(dá)可能與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后密切相關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示RUNX3蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的年齡、性別、是否攜帶病毒、腫瘤大小等臨床病理參數(shù)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。通過(guò)隨訪52例肝細(xì)胞癌患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)后生存時(shí)間越長(zhǎng)的患者，一般來(lái)說(shuō)其RUNX3蛋白表達(dá)率越高，進(jìn)一步表明RUNX3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后之間存在密切的相關(guān)性，這為判斷肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的指標(biāo)提供了依據(jù)。

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A

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