家兔離體心臟灌流試驗(yàn)的改進(jìn)及其效果

袁 亮，高慧麗，高蓮蓮，劉耀武，陳 楠，肖云云，丁建中，賀尚榮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

家兔離體心臟灌流試驗(yàn)的改進(jìn)及其效果

袁 亮，高慧麗，高蓮蓮，劉耀武，陳 楠，肖云云，丁建中，賀尚榮
(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：通過改進(jìn)離體心臟灌流試驗(yàn)，延長(zhǎng)家兔離體心臟存活時(shí)間。方法:健康大耳長(zhǎng)白家兔10只隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組, 每組5只；通過改良Krebs-Henseleit液(K-H)配方與部分術(shù)式操作，比較兩組的體外存活時(shí)間。 結(jié)果：與對(duì)照組比較, 改進(jìn)組家兔離體心臟在體外穩(wěn)定有節(jié)律跳動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。結(jié)論：改良部分手術(shù)操作以充分暴露離體心臟, 加之去掉K-H配方之Na2EDTA而減少與Ca2+絡(luò)合以相對(duì)提高有效Ca2+濃度,伴同時(shí)增加鎂離子濃度, 以共同改善心肌收縮功能和延長(zhǎng)離體兔心臟存活時(shí)間。此簡(jiǎn)捷模型宜用于專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與篩選心臟藥物等研究。

離體心臟灌流試驗(yàn)；改良配方/術(shù)式；離體

1895年Langendorff首創(chuàng)哺乳動(dòng)物離體心臟進(jìn)行心臟泵功能研究, 常用Krebs-Henseleit(K-H液)液為離體心臟提供必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。使用大型哺乳動(dòng)物離體心臟的主要困難是動(dòng)物費(fèi)用高，參數(shù)變異較大，需大容量的灌流液等儀器設(shè)備[1]，而蛙心與鼠心體積較小而不易操作, 兔心臟多因離體復(fù)蘇較難與存活時(shí)間較短而應(yīng)用受限。我們多次發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)K-H液進(jìn)行離體兔心臟灌注液時(shí)，其心臟快速?gòu)?fù)蘇與存活時(shí)間均難控制[2]。為此課題組改良Krebs-Henseleit配方和部分剖取兔心臟術(shù)式操作，結(jié)果顯示可適當(dāng)延長(zhǎng)家兔離體心臟的體外存活時(shí)間。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康大耳長(zhǎng)白家兔10只，體質(zhì)量(2500±100)g， 雌雄不限，由長(zhǎng)江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2儀器 LGF-1B型Langendorff灌流儀， HS-4CB型恒溫水浴槽，RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)，均為成都儀器廠產(chǎn)品。

1.1.3試劑 肝素鈉注射、烏拉坦、KCl(20090828)、MgSO4·7H2O(20090613)、CaCl2(20090728)均購(gòu)于天津市博迪化工有限公司；KH2PO4(20080327)、NaHCO3(20080525均為成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；C6H12O6·H2O(20090616為天津市紅巖化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。以上試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1 改良K-H液配方 采用雙蒸水、按表1新鮮配制常規(guī)K-H與改良K-H，并置4℃普通冰箱內(nèi)備用(pH7.4)，臨用時(shí)加入葡萄糖。同時(shí)制備冰塊備用。

表1 兩種K-H液配方 g/L

1.2.2 家兔離體心臟模型的制備 10只實(shí)驗(yàn)家兔隨機(jī)分為對(duì)照組與改進(jìn)組，每組5只。常規(guī)經(jīng)兔耳緣靜脈注射0.3ml肝素鈉注射液抗凝后，行20%烏拉坦靜脈注射麻醉(5ml/kg)。

1)對(duì)照組。常規(guī)經(jīng)正中線開胸摘取兔心臟，快速經(jīng)主動(dòng)脈注射4℃充氧的K-H液以沖洗兔心臟血管內(nèi)殘血后，將兔心臟置Langendorff灌流儀[Langendorff灌流儀每10cm液柱內(nèi)持續(xù)出現(xiàn)2～3個(gè)氣泡為宜，調(diào)節(jié)并使從Langendorff灌流儀下端流出的灌流液溫度維持為(37±0.5)℃，下同]。用常規(guī)K-H液從30℃緩升至37℃恒溫進(jìn)行心臟灌流。

2)改進(jìn)組。經(jīng)胸骨下角切口、沿右鎖骨中線開胸，向左翻起胸壁以充分暴露心臟；鈍性分離心包并在近心尖處之壁層心包膜上做一小切口；游離心臟，剪斷心底與心臟相連的血管并保留主動(dòng)脈2～3cm后立即置于用適量冰塊維持的4℃充氧的K-H液中，手揉法擠出心腔內(nèi)殘血，快速經(jīng)主動(dòng)脈注射4℃充氧的改良K-H液以沖洗心臟血管內(nèi)殘血；同時(shí)快速修剪心臟表面附著的其它組織，暴露和結(jié)扎主動(dòng)脈根部并將其固定于Langendorff灌流儀。灌注液溫度從30℃緩升至37℃，記錄從取出心臟至成功復(fù)跳所需時(shí)間。

1.2.3 數(shù)據(jù)信號(hào)采集 待心臟成功復(fù)跳后，將導(dǎo)水管從肺靜脈逆行插入左心室檢測(cè)左心室內(nèi)壓，將黑、綠、紅三個(gè)電極探針分別接心尖、右心房、右心室，RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)監(jiān)測(cè)心臟功能狀態(tài)，自動(dòng)持續(xù)記錄離體心臟最長(zhǎng)存活時(shí)間。

2 結(jié) 果

表2 兩種處理方法的離體兔心臟存活狀態(tài)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。

兩組離體心臟在4℃ K-H液中短暫停搏，經(jīng)主動(dòng)脈根部灌流后1min內(nèi)即可觀測(cè)到心臟復(fù)跳，一般是兩心房首先復(fù)跳，而后兩心室開始復(fù)跳，約10min可穩(wěn)定跳動(dòng)，心電圖顯示部分有心律不齊的表現(xiàn)，但心跳穩(wěn)定后能維持竇性心律，用RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)可測(cè)到規(guī)則的左心室內(nèi)壓曲線和心電圖。改進(jìn)組離體兔心臟復(fù)蘇快且可穩(wěn)定跳動(dòng)≥8h，優(yōu)于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

3 討 論

文獻(xiàn)報(bào)道制備離體兔心臟多用正中線開胸術(shù)式，但課題組多次操作時(shí)發(fā)現(xiàn)此種方式因視野暴露有限而易傷及心臟，故而改用從兔胸骨下角開始并沿右鎖骨中線開胸術(shù)式，因?yàn)楸荛_了心包區(qū)而可免損及心臟；同時(shí)將左側(cè)胸壁提起翻向左側(cè)，可以完全暴露心臟的相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)，尤其是主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、上腔靜脈、下腔靜脈等大血管，便于選擇合適的部位剪斷血管和取出心臟且操作簡(jiǎn)便。

我們將離體兔心臟置于周圍放置適量冰塊的4℃ K-H液的容器中，此種簡(jiǎn)便條件可使心臟短暫停跳而呈低能耗狀態(tài)，一方面有利于快速修剪心臟表面附著的多余其它組織以充分暴露并結(jié)扎主動(dòng)脈根部；另一方面低溫狀態(tài)下的心肌細(xì)胞內(nèi)的酶活性受抑，細(xì)胞能耗、氧耗下降而減少心臟在無能量供應(yīng)條件下心肌細(xì)胞的代謝損傷。我們注意到，進(jìn)行離體兔心臟灌流時(shí)，灌流液的溫度應(yīng)從30℃緩慢升至37℃約需2～3min，此適應(yīng)過程可避免從4℃環(huán)境直升為37℃的初期供氧與灌流液溫度條件變化而帶來的心肌內(nèi)環(huán)境紊亂，尤其是心肌酶活性迅速增加和心肌代謝及能耗增加造成的繼發(fā)性損傷[3]。

與對(duì)照組比較，改進(jìn)組之離體心臟在心跳穩(wěn)定后能維持竇性心律，可穩(wěn)定跳動(dòng)7～8h且重復(fù)性良好。Ca2+是維持心肌收縮所必需的物質(zhì)，心肌興奮時(shí)Ca2+穿過細(xì)胞膜進(jìn)入心肌細(xì)胞，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)收縮蛋白的收縮過程，血鈣濃度升高時(shí)心肌收縮加強(qiáng)[4]。Na2EDTA是常用的金屬離子螯合劑，而改進(jìn)組的改良K-H液配方中去掉了Na2EDTA，因而減少了Na2EDTA與溶液中Ca2+絡(luò)合后形成CaNa2EDTA的機(jī)會(huì)，相對(duì)提高灌注液的有效Ca2+濃度而有利于維持心肌細(xì)胞的收縮機(jī)能。

鎂離子在正常細(xì)胞代謝的許多酶系統(tǒng)的激活過程中影響細(xì)胞對(duì)Ca2+攝取及分布，而使Ca2+向細(xì)胞內(nèi)的流動(dòng)減慢而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少；通過無鈣灌流10～15min后復(fù)鈣灌流5min造成大鼠離體心肌鈣反常損傷，結(jié)果顯示鎂等陽離子保護(hù)組之冠流液的乳酸脫氫酶含量均有下降，電鏡觀察心肌細(xì)胞損傷有一定程度減輕。臨床應(yīng)用門冬氨酸鉀鎂能改善心肌收縮力、傳導(dǎo)功能和自律性[5]。本實(shí)驗(yàn)中我們將改良K-H液中的鎂離子濃度增加近3倍，結(jié)合去掉K-H液中Na2EDTA以增加Ca2+濃度與改良部分剖取兔心臟術(shù)式操作，達(dá)到延長(zhǎng)離體兔心臟存活時(shí)間的效果。該簡(jiǎn)易模型可為專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與心臟藥物機(jī)制研究提供簡(jiǎn)便平臺(tái)，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]李海濤，王俊亞，張東梅，等.離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)方法的類比研究[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2007，25(15)：116-117.

[2]鐘富有，肖海，李洪亮，等.3’-大豆苷元磺酸鈉對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(11)：2590-2591.

[3]劉春，馬瑞，余志斌，等.變溫過程中大鼠心肌等長(zhǎng)收縮發(fā)展張力呈雙相變化[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，1998，14(1)：59-62.

[4]朱大年.生理學(xué)[M]. 7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：83.

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.006

R331.31

A

1673-1409(2010)03-R012-03