影響日本結(jié)縷草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間的相關(guān)因子研究

劉雅麗，費(fèi)永俊

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州430025)

曾會(huì)明

(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083)

影響日本結(jié)縷草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間的相關(guān)因子研究

劉雅麗，費(fèi)永俊

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州430025)

曾會(huì)明

(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083)

誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間是愈傷組織誘導(dǎo)過程中的關(guān)鍵參數(shù)。本研究以日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)成熟種子為材料，研究了研磨、接種方式和浸泡等因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，在MS + 2,4-D 5 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂7 g/L培養(yǎng)基上，pH5.8時(shí)，研磨處理的結(jié)縷草種子愈傷組織誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于未研磨處理的；隨機(jī)接種方式的愈傷組織誘導(dǎo)率高于機(jī)械接種方式的；浸泡72h后愈傷組織誘導(dǎo)率高。結(jié)果表明，在研磨情況下，日本結(jié)縷草種子浸泡72 h后，采取隨機(jī)接種方式，培養(yǎng)第5～7 d即出現(xiàn)愈傷組織，第9～11 d愈傷組織發(fā)生達(dá)到高峰期，第14 d便可進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)95.6%。

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)；愈傷組織；誘導(dǎo)率；出愈時(shí)間

結(jié)縷草(Zoysia)屬禾本科畫眉草亞科結(jié)縷草屬，廣泛分布于亞洲和大洋洲的熱帶、亞熱帶甚至溫帶地區(qū)，是當(dāng)今世界上公認(rèn)的優(yōu)良暖季型草坪草種[1，2]，是唯一的國(guó)產(chǎn)草坪草，也是我國(guó)草坪植物中栽培最早、應(yīng)用最多的草種之一。日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)具有耐踐踏、富有彈性、抗旱、低矮致密、耐修剪、耐高溫、對(duì)氣候和土壤適應(yīng)性廣等許多的優(yōu)良性狀，在城市草坪和運(yùn)動(dòng)草坪中得到了廣泛的應(yīng)用[3，4]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)日本結(jié)縷草愈傷組織的誘導(dǎo)、再生分化體系進(jìn)行了一些研究[5～11]。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道的結(jié)縷草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率在34.2%～57.3%之間[5～7]。由于日本結(jié)縷草的誘導(dǎo)率較低、出愈時(shí)間較長(zhǎng)[5～10]，高效組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)化體系建立困難。本研究以日本結(jié)縷草成熟種子為外植體，研究浸泡、研磨和接種方式等因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期為優(yōu)化日本結(jié)縷草組織培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本結(jié)縷草‘Zenith’品種種子由美國(guó)TMI公司(Turf Merchants，Inc)惠贈(zèng)。

1.2 材料消毒

種子置于50 mL離心管中，加入1～2滴Tween-20和35 mL次氯酸鈉原液(有效氯gt;10.0%)，磁力攪拌器上攪拌1 h，無菌水沖洗5～6次，40 mL無菌水?dāng)嚢?.5 h，無菌水沖洗5～6次，加入20 mL無菌水置于4 ℃冰箱浸泡2～3 d。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌水沖洗2次，加入35 mL次氯酸鈉原液，再加去離子水至50 mL，攪拌20 min，無菌水沖洗5～6次，備用。

1.3 研磨處理

將經(jīng)過消毒的種子用無菌水清洗3～5次，在接種前將種子在無菌研缽中研磨5 min。

1.4 浸泡處理

對(duì)無菌處理的結(jié)縷草成熟種子分別浸泡48 h、60 h和72 h，研磨后接種。每種處理5個(gè)重復(fù)，第3 d、5 d、7 d、14 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率(其中第3 d的數(shù)據(jù)為發(fā)芽率)。

1.5 接種方式

機(jī)械接種：將種子一粒一粒排列接種于培養(yǎng)基上。每皿種子數(shù)為100粒。

隨機(jī)接種：將隨機(jī)所取的種子放置于無菌濾紙上，晃動(dòng)濾紙，使種子自然分散，將濾紙倒扣于培養(yǎng)基上，揭去濾紙。每皿種子數(shù)100粒。

1.6 愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒處理過的種子接種在MS5+L-Pro培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為MS + 2,4-D 5 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂 7 g/L，pH5.8，愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MSD(MS無機(jī)鹽 + B5有機(jī)物)+ 2,4-D 1 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂7 g/L，pH5.8。28 ℃黑暗培養(yǎng)，待種子萌發(fā)的芽基部出現(xiàn)白色的愈傷小塊后，除去萌發(fā)的芽體，以促進(jìn)愈傷小塊的生長(zhǎng)。接種15 d后對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨處理對(duì)日本結(jié)縷草種愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

注:利用LSD法進(jìn)行多重比較。同行標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著。圖2、圖3同。圖1 研磨處理對(duì)結(jié)縷草種愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Figure 1 Effect of grinding on the induction of callus

將研磨和未研磨的結(jié)縷草種子采用機(jī)械接種方式接種至培養(yǎng)基上。接種第3 d種子胚處出現(xiàn)芽點(diǎn)，研磨處理的種子發(fā)芽率達(dá)到36.4%，而未研磨的發(fā)芽率僅1.4%；接種第5 d種子芽基部有白色突起，研磨后種子誘導(dǎo)率達(dá)到42.6%，而未研磨的僅為2.2%；接種第7 d白色突起形成愈傷組織，第9 d愈傷組織發(fā)生達(dá)到高峰期，接種第14 d即可對(duì)愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，此時(shí)研磨后種子的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)64.6%，未研磨的為11.4%(圖1)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸增加。在研磨處理下，第3 d、第5 d、第7 d和第14 d之間差異極顯著；而未研磨處理的結(jié)縷草種子愈傷組織誘導(dǎo)率在第3 d、第5 d、第7 d之間差異不顯著，第14 d與第3 d、第5 d、第7 d差異極顯著(表1)。結(jié)果表明，研磨能顯著提高日本結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)率。根據(jù)這一結(jié)果，以下實(shí)驗(yàn)均在研磨后進(jìn)行。

表1 在不同處理下不同時(shí)間結(jié)縷草種子愈傷組織誘導(dǎo)率的變化Table 1 The change of callus induction rate at different time under different treatments %

注：利用Duncan法進(jìn)行多重比較。同列標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著。

2.2 接種方式對(duì)日本結(jié)縷草種愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

將研磨后日本結(jié)縷草種子采取機(jī)械接種和隨機(jī)接種2種接種方式接種于培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。由表1可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，隨機(jī)接種的愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸增加，并且第3 d、第5 d、第7 d和第14 d之間差異極顯著；但機(jī)械接種是愈傷組織誘導(dǎo)率在第3 d、第5 d、第7 d之間差異不顯著，而第14 d與第3 d、第5 d、第7 d差異極顯著。而且由圖2可以看出，接種第3 d、第5 d和第14 d，隨機(jī)接種愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于機(jī)械接種的。根據(jù)這一結(jié)果，以下實(shí)驗(yàn)采取隨機(jī)接種。

圖2 不同接種方式對(duì)結(jié)縷草種愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Figure 2 Effect of transferring ways on the induction of callus

2.3 浸泡處理結(jié)縷草種子對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

圖3 不同浸泡處理對(duì)結(jié)縷草種愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Figure 3 Effect of immersing on the induction of callus

由表1可知，浸泡48 h和浸泡60 h的愈傷組織誘導(dǎo)率在第3 d、第5 d、第7 d和第14 d差異極顯著，而浸泡72 h的在第3 d、第5 d差異顯著，第7 d和與14 d差異不顯著，結(jié)果表明，浸泡后結(jié)縷草種子愈傷組織誘導(dǎo)率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。由圖3則可以看出，接種后第3 d、第5 d，浸泡48 h與浸泡60 h的愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著，但顯著低于浸泡72 h的；接種第7 d、第14 d，3種浸泡時(shí)間愈傷組織誘導(dǎo)率差異極顯著，而且浸泡72 h的愈傷組織誘導(dǎo)率最高。結(jié)果表明，結(jié)縷草種子研磨過的種子浸泡72 h后采用隨機(jī)接種方式接種，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

3 小結(jié)與討論

誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間是單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中的重要因素，本研究通過研磨、浸泡和接種方式等方式處理，縮短了出愈時(shí)間，提高了誘導(dǎo)率。

(1) 自1987年Al-Khayri等[11]以日本結(jié)縷草成熟種子建立植株再生體系后，不斷有以日本結(jié)縷草莖尖、幼穗、節(jié)段為外植體建立植株再生體系的報(bào)道[6,12～14]。張俊衛(wèi)等[7]認(rèn)為誘導(dǎo)結(jié)縷草愈傷組織最佳2,4-D濃度為1～2 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)57.3%。齊春輝等[5]則認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可提高愈傷組織誘導(dǎo)率。但在本研究中，2,4-D濃度為5 mg/L的愈傷組織最高可達(dá)95.6%，明顯高于張俊衛(wèi)[7]、李瑞芬等[6]的結(jié)果，可能是因?yàn)楸狙芯坎捎玫奈锢硎侄未蚱屏私Y(jié)縷草種的休眠，促進(jìn)和誘發(fā)了結(jié)縷草愈傷組織的形成。

(2)研究表明，結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)在培養(yǎng)15～18 d后才觀察到白色突起，20～25 d愈傷組織達(dá)到高峰期，30～40 d才能進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)和繼代[15～17]。而本研究表明，培養(yǎng)3 d觀察到種子胚處出現(xiàn)芽點(diǎn)，培養(yǎng)5 d即可觀察到種子芽基部有白色突起，7 d有愈傷組織形成，9 d愈傷組織達(dá)到高峰期，14 d即可對(duì)愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，大大縮短了出愈時(shí)間。

(3)本研究表明，研磨后的愈傷組織誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未研磨處理?？赡苁怯捎谌毡窘Y(jié)縷草種子表層有較厚的保護(hù)層，研磨處理造成種子表層的保護(hù)層的破裂，打破了種子休眠，激發(fā)種子活性，提高種子的發(fā)芽率和愈傷組織誘導(dǎo)率。研磨處理時(shí)應(yīng)以種子種皮磨損為宜。研磨程度過重，種子內(nèi)部受損，發(fā)芽率自然不高，研磨程度過輕，種子外皮的蠟質(zhì)保護(hù)層并沒有受到破壞，種子發(fā)芽率也不高。

(4)研究表明，用水浸泡處理和綜合處理的方法可以快速有效地促進(jìn)種子發(fā)芽。方文娟[18]在對(duì)日本結(jié)縷草‘Zenith’品種浸泡處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，該品種的最佳浸泡時(shí)間為2～3 d，愈傷組織誘導(dǎo)率增長(zhǎng)了1.26倍，但隨著浸泡時(shí)間再延長(zhǎng)，種子生活力下降，愈傷組織誘導(dǎo)率也相應(yīng)下降。本研究中浸泡72 h的日本結(jié)縷草種愈傷組織誘導(dǎo)率高于浸泡48 h和60 h，與方文娟的結(jié)果類似。

(5)在采用機(jī)械接種和隨機(jī)接種2種接種方式時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果差異極顯著，原因有待進(jìn)一步研究。

[1]張新全.草坪草育種學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.310～323.

[2]胡中華,劉師漢.草坪與地被植物[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1995.94～101.

[3]陳志一.草坪栽培與養(yǎng)護(hù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.57.

[4]沈國(guó)輝，何云芳，楊 烈.草坪雜草防除技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2002.27.

[5]胡繁榮.結(jié)縷草組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化因子的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，(2)：21～24.

[6]李瑞芬，張敬原，趙茂林.結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生[J].園藝學(xué)報(bào)，2003，30(3)：355～357.

[7]張俊衛(wèi)，唐 蜻，包滿珠.日本結(jié)縷草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響因子分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(2)：368～374.

[8]齊春輝，韓烈保，黃 麟，等.幾種因素對(duì)日本結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)與生長(zhǎng)影響的研究[J].2005，(4)：1～3.

[9]杜敏華，柴春月.日本結(jié)縷草立體培養(yǎng)及高頻率植株的再生[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35(10)：17～19.

[10]張俊衛(wèi)，唐 蜻，包滿珠.日本結(jié)縷草植株再生體系的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14(2)：48～51.

[11]Al-Khayri J M,Huang F H,Thompson L F,etal. Plant regeneration of zoysiagrass from embryo-derived callus[J]. Crop Science,1989,29: 1324～1325.

[12]Yoo Y K,Kim K S. Effects of plant growth regulators on callus formation and organogenesis from the shoot-tip cultures of five turfgrass species[J]. Journal of the Korean Society for Horticultural Science,1991,32: 237～246.

[13]Poeaim A,Mstduda Y,Murata T. Plant regeneration from immature inflorescence of zoysiagrass[J]. Plant Biotechnology,2005,22: 245～248.

[14]Inokuma C,Sugiura K,Imaizumi N,etal. Transgenic Japanese lawngrass (Zoysiajaponica.) planrs regenerated fromprotoplasts[J]. Plant Cell Reports,1998,17: 334～338.

[15]韋善君，孫振元，錢永強(qiáng)，等.中華結(jié)縷草成熟胚的離體培養(yǎng)再生植株[J].植物生理學(xué)通訊，2004，(4)：470.

[16]錢永強(qiáng)，孫振元，韋善君，等.中華結(jié)縷草成熟胚再生影響因素研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，19(6)：436～440.

[17]趙永輝，王尊生，曾曉菲.結(jié)縷草的組織培養(yǎng)[J].沈陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，(4)：299～231.

[18]方文娟.日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)懸浮再生體系的建立與超低溫保存研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

2009-11-19

國(guó)家”863”計(jì)劃(2006AA10Z132)；北京林業(yè)大學(xué)博士點(diǎn)基金(20070417)

劉雅麗(1985-)，女，湖北天門人，碩士研究生，研究方向?yàn)椴萜翰萦N.

費(fèi)永俊，E-mail:fyj2010@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.016

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S063-04