8個青花菜栽培品種的ISSR和SSR的遺傳多樣性分析

李昕珈，吳明根

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 龍井 133400)

潘 剛

(浙江大學農(nóng)學院，浙江 杭州 310029)

8個青花菜栽培品種的ISSR和SSR的遺傳多樣性分析

李昕珈，吳明根

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 龍井 133400)

潘 剛

(浙江大學農(nóng)學院，浙江 杭州 310029)

采用20個ISSR引物和100對SSR引物，分析了來自中國和美國的8個青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)栽培品種的遺傳多樣性。分別獲得35個和22個多態(tài)性片段，平均分別為3.5個和2.2個；根據(jù)ISSR和SSR標記計算出品種遺傳距離分別在0.271 3～0.970 2之間和0.175 7～0.922 3之間；聚類分析將8個品種分成2大類；根據(jù)2種標記計算的遺傳距離及其遺傳關(guān)系，所得結(jié)果基本一致，但存在一定差異。

青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)；ISSR；SSR；遺傳多樣性

青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)又稱綠菜花、綠花菜、莖椰菜、西蘭花等，屬十字花科蕓薹甘藍種中的一個變種。青花菜不僅營養(yǎng)成分含量高，而且十分全面，主要包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、礦物質(zhì)、維生素C和胡蘿卜素等。此外，青花菜還具有抗癌功效，并含有豐富的抗壞血酸，能增強肝臟的解毒能力，提高機體免疫力[1]。

ISSR為顯性標記，由Zietkiewicz等[2]于1994年發(fā)明，是建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新型的分子標記技術(shù)[3]。它結(jié)合了RAPD和SSR標記的優(yōu)點，具有穩(wěn)定性較高、重復性好、多態(tài)性高等特點，已在種植資源鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣化、進化、系統(tǒng)發(fā)育、分子標記育種等方面得到應用[4～6]，尤其被廣泛用于蕓薹屬作物的遺傳多樣性研究[7，8]。而SSR標記則是一類共顯性標記，其遺傳方式簡單、穩(wěn)定性高、操作簡便、重復性好，被廣泛用于遺傳作圖、種質(zhì)鑒定、分子標記輔助選擇等方面[9]，被迅速應用于種質(zhì)資源的評價和研究當中[10]。

本研究采用ISSR標記和SSR標記，從分子水平上研究不同地域、不同生育期青花菜品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性的差異，以期為青花菜育種提供的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇來自國內(nèi)外的8個青花菜品種為供試材料，其中國內(nèi)6個品種為‘優(yōu)秀’、‘未來’、‘山水’、‘山水’、‘早生’和‘曼陀綠’，2個國外品種為‘Arcadia’和‘Belstar’。

1.2 方法

(1)總DNA提取 每品種分別選取15粒種子，于28 ℃萌發(fā)，至2葉1心時取10株幼苗葉片混合，參照Saghai-Maroof等[11]的方法，采用CTAB小樣法提取樣品總DNA。

(2)PCR反應 ISSR分析引物采用加拿大哥倫比亞大學提供的序列(表1)，由上海生工生物工程公司合成20條引物。擴增反應條件為20 μL PCR反應體積，1×PCR緩沖液， 1 U Taq酶(北京鼎國)，50 ng模板DNA，1 μmol/L引物，1 mmol/L dNTP。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

表1 ISSR引物序列Table 1 The sequences of ISSR primers

SSR分析根據(jù)Iniguez-Luy等[12]的序列合成100對SSR引物，SSR反應參照Saal等[13]的方法，采用20 μL PCR體系。所有PCR擴增產(chǎn)物均用3%的瓊脂糖膠進行分離。

(3)數(shù)據(jù)采集 根據(jù)分子標記的電泳譜帶，分別統(tǒng)計各樣本有多態(tài)性的ISSR和SSR擴增條帶，有帶記為1，無帶記為0。

(4)遺傳相似性分析 參照文獻[14]利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)0-1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析軟件，采用Jaccard法計算遺傳相似系數(shù)F，并按公式F=N11/(N-N00) 轉(zhuǎn)換成遺傳距離。其中，N為譜帶位數(shù)；N11為2個個體都有帶的位數(shù)；N00為2個個體都無帶的位數(shù)。

(5)聚類分析 采用類平均UPGMA法做聚類分析，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)0-1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析軟件分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR和SSR標記的遺傳多樣性分析

A～H為青花菜品種，M為DL2000圖1 ISSR引物(ubc17)(a)和SSR引物(b)在材料中的擴增結(jié)果Figure 1 Amplified profile by ISSR primer (ubc17) (a) and SSR primer(b)

用20條引物對8個品種進行擴增，其中16條引物能夠擴增出清晰的且可重復的帶(圖1a)，其中有多態(tài)性的引物為10條，共擴增出35個位點，多態(tài)性位點為13個，多態(tài)性位點百分率為37.14%，說明這8個品種間的遺傳多樣性一般。而100對SSR引物中，僅有10對存在多態(tài)性，每對引物檢測到的多態(tài)性片段為1～3條(圖1b)，平均每對引物2.2個，一共獲得了22個多態(tài)性的位點。ISSR的平均擴增出的多態(tài)性標記數(shù)是SSR的1.59倍。

2.2 青花菜品種間的遺傳分析

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)根據(jù)青花菜任意2個品種的ISSR或SSR電泳條帶數(shù)據(jù)，利用Jaccard法計算出各品種間的遺傳相似系數(shù)，并轉(zhuǎn)換成遺傳距離。結(jié)果顯示，ISSR標記計算的各品種之間遺傳距離在0.271 3～0.970 2之間，最大值為0.970 2(‘優(yōu)秀’與‘Arcadia’間)，最小值為0.271 3(‘Arcadia’與‘Belstar’間)。SSR分析顯示，各品種間的遺傳距離在0.175 7～0.922 3之間，最大值為0.922 3(‘Arcadia’與‘Belstar’間)，最小值為0.175 7(‘Arcadia’與‘Belstar’間)。這些結(jié)果顯示，SSR標記結(jié)果的遺傳距離的范圍比ISSR大，而且兩者之間也存在一定差異。相對而言，SSR標記比ISSR標記能檢測到更大的遺傳變異。

圖2 8個青花菜品種的ISSR(a)和SSR(b)標記聚類圖Figure 2 Dendrogram of 8 broccoli cultivars based on ISSR(a) and SSR(b)

2.3 青花菜的聚類分析

8個青花菜品種的Jaccard數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析，以類平均法進行聚類分析。SSR聚類結(jié)果(圖2b)顯示，以0.57為界限可以將8個品種分成2大類，其中‘優(yōu)秀’、‘未來’和‘早生’3個品種聚成一大類，其他5個品種聚為另一大類，2大類之間似乎與其生長特性沒有什么關(guān)聯(lián)。而ISSR聚類的結(jié)果(圖2a)顯示，以0.53為界限也可以將8個品種分成2大類，其中第一類僅有‘優(yōu)秀’和‘未來’2個品種，而‘早生’則整合到另一大類。結(jié)果表明，ISSR的聚類結(jié)果與SSR的十分相似，但還是存在一定差異。

3 討論

本研究利用ISSR標記和SSR標記對國內(nèi)外8個主栽品種進行了遺傳多樣性分析，具有多態(tài)性的標記并不多，其中ISSR的為10條，占50%，而SSR則僅有10對，僅占10%。利用這些標記分析青花菜的結(jié)果表明8個品種基本可以分成2大類，但2種標記之間卻存在一定差異，這與前人的研究結(jié)果[15]基本一致。2種標記存在一定差異可能與2種不同標記的特性有關(guān)，一是SSR標記檢測的DNA重復序列，而ISSR卻是檢測重復序列間的DNA片段；二是SSR引物擴增條件相對穩(wěn)定，重復性好，而ISSR引物由于存在一定的兼并堿基或重復序列，從而導致擴增的穩(wěn)定性相對于SSR引物而言不太高。

遺傳多樣性的研究是青花菜種質(zhì)資源研究的主要內(nèi)容之一。利用分子標記技術(shù)，可以較為全面地了解現(xiàn)有青花菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，從而可以根據(jù)品種間遺傳距離選配強優(yōu)勢雜交組合，加快育種進程，減少育種中親本選配的盲目性， 提高育種效率[16]。

[1]唐曉偉．西蘭花營養(yǎng)最高[J]．花卉，2006，(7)：33～33．

[2]Zietkiewice E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20: 176～183.

[3]Lih S,Chen G Z.Genetic diversity of sonneratiaalba in China detected by inter-simple sequence repeat(ISSR) analysis[J].Acta Botanica Sinica,2004,46: 515～521

[4]王建波．ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J]．遺傳，2002，24(5)：613～616．

[5]Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochem Bul,1987,19: 11～15.

[6]高 麗，楊 波．春蘭ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化[J]．華中農(nóng)業(yè)大學學報，2006，25(3)：305～309．

[7]郭小平，劉毓俠．SSR技術(shù)及其在植物遺傳育種中的應用[J]．華北農(nóng)學報，1998，13(3)：73～76．

[8]劉志文，單連民，韓 旭，等．現(xiàn)代生物技術(shù)在油菜遺傳改良上的應用和進展[J]．華中農(nóng)業(yè)大學學報，2007，26(6)：900～906．

[9]柳曉磊，湯 華，李東棟，等．椰子SSR反應體系的建立和優(yōu)化[J]．華中農(nóng)業(yè)大學學報，2007，26(5)：676～679．

[10]高志紅，章 鎮(zhèn)，韓振海．SSR技術(shù)及其在果樹上的應用[J]．果樹學報，2002，19(5)：281～285．

[11]Saghai-Maroof M A,Soliman K M,Jorgensen R A,etal.Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: mendelian inheritance,chromosomal location and population dynamics[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81: 8014～8018.

[12]Iniguez-Luy F L,Voort A V,Osborn T C.Development of a set of public SSR markers derived from genomic sequence of a rapid cyclingBrassicaoleraceaL.genotype[J].Theor Appl Genet,2008,117: 977～985.

[13]Saal B,Plieske J,Hu J,etal.Microsatellite markers for genome analysis inBrassica,II assignment of rapeseed microsatellite to the A and C genomes and genetic mapping inBrassicaoleraceaL[J].Theor Appl Genet,2001,102: 695～699.

[14]唐啟義，馮明光．實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]．北京：科學出版社，2002．

[15]李進波，江良榮，李春海，等．水稻光溫敏核不育系的ISSR和SSR遺傳分析比較[J]．分子植物育種，2003，1(1)：42～47．

[16] Singh R K,Sharma R K,Singh A K,etal.Suitability of mapped sequence tagged microsatellite site markers for establishing distinctness,uniformity and stability in aromatic rice[J].Euphytica,2004,135: 135～143.

2009-11-18

李昕珈(1984-)，女，吉林吉林人，碩士研究生，主要從事雜草稻抗逆性及青花菜遺傳多樣性的研究.

吳明根，E-mail：5minggen@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.013

Q75

A

1673-1409(2010)01-S053-03