腎小管損傷標志物在局灶節(jié)段性腎小球硬化患者中的變化及意義

湯天鳳 鄭春霞 尹 茹 張 炯 劉志紅

腎小管間質(zhì)損傷是各種急、慢性腎臟病的共同特征,目前臨床上診斷腎小管間質(zhì)損傷的尿液生物學標志物主要有 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、尿胱抑素 C(CysC),以及近年來發(fā)現(xiàn)的腎損傷分子 1(kidney injury molecule-1,KIM-1)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil-gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、白介素 18(IL-18)。后三者主要用于預測發(fā)生急性腎損傷(AKI)的風險,KIM-1、NGAL在蛋白負荷性腎病、間質(zhì)纖維化等慢性腎損傷時亦表達增高[1]。關(guān)于這些功能學指標在不同類型腎臟疾病和不同性質(zhì)腎小管間質(zhì)病理改變時的表達變化,目前尚缺乏系統(tǒng)研究。因此,本研究主要觀察經(jīng)腎活檢明確診斷為局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者的腎小管間質(zhì)損傷情況,選擇同樣以蛋白尿和足細胞病變?yōu)橥怀霰憩F(xiàn)的膜性腎病(MN)、微小病變(MCD)作為疾病對照,對目前臨床應(yīng)用的各種腎小管功能指標進行評價,尋找更為敏感特異的生物學標志物。

對象和方法

研究對象 選擇 2009年4月至 2010年2月間在本單位住院,行腎活檢病理診斷為特發(fā)性 FSGS、MN、MCD的患者,有下列情況之一者除外:(1)合并藥物或感染相關(guān)小管間質(zhì)性腎炎;(2)繼發(fā)性腎小球疾病,如糖尿病腎病、高血壓腎損害、肥胖相關(guān)腎損害、有機溶劑腎損害等;(3)中毒、創(chuàng)傷、感染、手術(shù)相關(guān)急性腎臟損傷(AKI);(4)其他:終末期腎臟疾病(ESRD)、多囊腎、腎移植、腫瘤、肝硬化、活動性感染等。

研究方法 詳細記錄研究對象一般情況(性別、年齡、病程)和實驗室指標(24h尿蛋白、腎小管功能、腎小球濾過功能、腎功能等),隨機尿查KIM-1、NGAL、IL-18水平。 KIM-1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自美國 R＆D公司,IL-18 ELISA試劑盒購自日本 MBL公司,具體實驗步驟參考說明書。NGAL單抗、生物素化 NGAL單抗購自英國AntibodyShop公司,96孔板購自 Nun dumc公司,具體包被及檢測步驟參考 Kjeldsen L等的方法[2]。尿液標本分別以 1∶10,1∶100稀釋。

腎臟病理 所有患者在 B超引導下行腎活檢術(shù),標本進行常規(guī)光學顯微鏡檢查。由兩名腎臟病理醫(yī)師雙盲法評估,詳細記錄小管間質(zhì)病變程度。急性病變指小管變性壞死(包括刷狀緣脫落、小管上皮細胞腫脹、顆?；蚩张葑冃浴⑸掀ぜ毎馄?、壞死、祼膜、小管炎等);慢性病變指小管萎縮、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)單個核細胞浸潤。急性 +慢性病變兼有急性和慢性化病變。分別按其占皮質(zhì)區(qū)的面積分為無病變、輕度(≤25%)、中度(＞25%且≤50%)和重度(＞50%),計 0～3分。

統(tǒng)計學分析 計量資料按其是否正態(tài)分布分別以平均值±標準差(±s)或中位數(shù)(最小值,最大值)表示。組間比較按照不同數(shù)據(jù)類型分別選用ANOVA檢驗、u檢驗。單元回歸相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)分析。分別根據(jù)尿 KIM-1、NGAL、IL-18變化行一元線性回歸分析,篩選與其變化相關(guān)的因素,其中單元回歸分析 P＜0.05者進入逐步法多元回歸分析。腎小管損傷標志物診斷腎小管間質(zhì)病變的準確性評價選用 ROC曲線。以上數(shù)據(jù)均以SPSS 11.0軟件進行分析處理。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

不同類型腎臟疾病患者的臨床特征 如表1所示,病理診斷明確為 60例特發(fā)性 FSGS、36例特發(fā)性 MN、30例 MCD且資料完整的患者進入本次研究,臨床表現(xiàn)為不同程度蛋白尿,均伴有低蛋白血癥,所有患者 SCr均 ＜176.8μmol/L。三組患者尿蛋白定量、腎功能、血清白蛋白、性別構(gòu)成比等一般病情資料無統(tǒng)計學差異。特發(fā)性 MN患者發(fā)病年齡較 FSGS、MCD增高(P＜0.05),FSGS患者病程較其他兩組更長(P＜0.05)。FSGS患者尿 KIM-1、NGAL、NAG、RBP、CysC、C3、α2-MG較 MN、MCD患者均明顯升高(P＜0.05)。

表1 FSGS、MN、MCD患者臨床特征比較

FSGS患者 KIM-1、NGAL、IL-18表達的臨床影響因素 本研究 FSGS患者中男性 41例,女性 19例,男女比例 2.16∶1,集中分布在青中年,平均年齡(28.20±12.89)歲。一元線性回歸分析 FSGS患者KIM-1、NGAL、IL-18與臨床資料的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)KIM-1、NGAL與蛋白定量 、BUN、SCr、血 CysC、尿NAG、RBP、CysC、C3、α2-MG等呈正相關(guān) (P＜0.05);IL-18與蛋白定量、血 CysC、尿 NAG、RBP、CysC、C3等呈正相關(guān)(P＜0.05);NGAL還與血清總蛋白及白蛋白呈負相關(guān)(P＜0.05)(表2)。逐步多元回歸分析顯示,KIM-1與血 SCr、尿 CysC、尿α2-MG、密切相關(guān)(R2=0.460,P＜0.01),IL-18與尿C3、尿 CysC密切相關(guān)(R2=0.273,P＜0.01),NGAL僅與尿 α2-MG獨立相關(guān)(R2=0.133,P＜0.05)。

進一步分析 60例 FSGS患者,尿 KIM-1、IL-18、NGAL升高的發(fā)生率分別為 91.7%、85%、68.3%,三者同時升高者占 61.7%。其中尿 KIM-1升高的患者較正常者血CysC水平增高(P＜0.05)。尿 NGAL升高的患者較正常者蛋白尿、BUN、尿 C3、α2-MG增高,血清總蛋白及白蛋白則顯著降低(P＜0.05)(表3)。

表2 FSGS患者尿 KIM-1、NGAL、IL-18的相關(guān)因素(一元線性回歸分析)

不同病理亞型 FSGS患者的腎臟損傷情況 60例特發(fā)性 FSGS,經(jīng)腎臟病理活檢證實經(jīng)典型 17例,頂部型 27例,細胞型 7例,塌陷型 6例,門周型 3例。細胞型 FSGS尿 NAG增高較頂部型有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);塌陷型尿 C3、α2-MG增高較頂部型有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);IL-18、NAGL水平亦升高,但未達統(tǒng)計學意義,可能與病例數(shù)較少有關(guān)(表4)。

表3 FSGS患者尿 KIM-1、NGAL、IL-18升高者與正常者的基礎(chǔ)情況

FSGS患者腎小管間質(zhì)病理改變對 NGAL、KIM-1、IL-18表達的影響 60例特發(fā)性 FSGS,經(jīng)腎臟病理活檢證實,存在小管變性壞死等急性病變患者18例,存在小管萎縮、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)單個核細胞浸潤等慢性病變者 8例,在慢性腎小管間質(zhì)病變基礎(chǔ)上合并急性病變的患者 32例。急性或慢性合并急性腎小管間質(zhì)病變患者與單純慢性腎小管間質(zhì)病變患者相比,尿 KIM-1、NGAL明顯增高(P＜0.01),血清白蛋白下降(P＜0.05)(表5)。

表4 不同病理亞型FSGS患者的基礎(chǔ)情況

表5 FSGS患者不同腎小管間質(zhì)病變時的基礎(chǔ)情況

腎小管損傷標志物診斷小管間質(zhì)急性病變的準確性評價 在進入本研究的三組病例中有 21例NAG、RBP尚在正常范圍內(nèi)的患者,分別有 96%、86%和 57%出現(xiàn)了尿 KIM-1、IL-18、NGAL的增高(圖1),進一步分析這部分患者的腎組織病理證實13例患者(62%)存在不同程度的急性腎小管間質(zhì)病變,其中 11例輕度腎小管變性壞死(≤25%,1'),2例中度腎小管變性壞死(＞25%且≤50%,2')。對于診斷腎小管間質(zhì)急性病變,尿 KIM-1、NGAL、CysC、NAG的 ROC曲線下面積大于 IL-18、RBP;其中 KIM-1水平為 1.96mg/L時診斷小管急性病變的特異性高達 91%(表6,圖2)。

表6 各種小管損傷標志物診斷 FSGS小管間質(zhì)急性病變的準確性評價

圖1 NAG、RBP正常的患者 KIM-1、IL-18、NGAL表達情況

討 論

腎小管間質(zhì)損傷是各種腎臟疾病大量蛋白尿形成的病理生理基礎(chǔ)之一,與疾病的嚴重程度與預后密切相關(guān),也是早期診斷和逆轉(zhuǎn)腎臟疾病進展的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的腎小管功能指標如微量白蛋白、尿低分子量蛋白、尿酶(NAG、RBP等)已廣泛應(yīng)用于臨床。新近發(fā)現(xiàn)的 KIM-1是一種Ⅰ型跨膜蛋白,與腎小管上皮細胞的早期損傷和修復有關(guān),腎小管早期損傷后即可在尿液中檢測出水平顯著增高[3,4]。NGAL分子量為 25 kD,具有鐵依賴性生物活性,能與鐵載體一起將鐵轉(zhuǎn)運至近端小管細胞胞質(zhì),通過胞內(nèi)溶酶體降解,進行鐵的循環(huán)利用,以減輕鐵催化引起的早期腎損傷。感染、炎癥、上皮細胞惡性轉(zhuǎn)分化等全身性因素引起的NGAL增高,均能通過腎小球濾過,但大部分被近端腎小管重吸收[5],尿 NGAL水平并不升高。有研究報道尿 NGAL水平可用來監(jiān)測腎病綜合征或間質(zhì)性腎炎患者腎小管重吸收功能以及對治療的反應(yīng)[6]。IL-18是由近端腎小管誘導產(chǎn)生的一種細胞因子,主要是通過招募中性粒細胞作為對缺血性損傷的反應(yīng)[7]。但是,對于不同類型的腎小球疾病,或合并不同性質(zhì)的腎小管間質(zhì)病理改變時,這些功能學指標的表達有何變化特點;反映腎小管間質(zhì)損傷的敏感性或特異性如何,目前尚無系統(tǒng)的研究。鑒于上述問題,本研究選取經(jīng)腎活檢明確為原發(fā)性 FSGS、MN、MCD的患者為研究對象,排除原發(fā)腎小管間質(zhì)疾病以及可繼發(fā)引起腎小管功能指標非特異性增高的因素,首次篩選出可以作為理想的腎小管損傷生物學標志物,在組織形態(tài)學改變早期診斷腎臟疾病。

FSGS、MCD和 MN是以大量蛋白尿起病的原發(fā)性腎小球疾病最常見的病因,均突出的表現(xiàn)為足細胞的病變[8]。我們觀察到 FSGS患者尿 KIM-1、NGAL、NAG、RBP等腎小管功能指標較同等程度蛋白尿的 MN、MCD患者顯著增高,但尚未發(fā)現(xiàn)尿IL-18水平較其他疾病存在差異,可能與 IL-18作為促炎性細胞因子,在細胞及體液免疫反應(yīng)中均可升高,缺乏疾病特異性有關(guān)。但有報道發(fā)現(xiàn),兒童原發(fā)性腎病綜合征復發(fā)患者尿 IL-18較緩解期患者明顯增高,提示尿 IL-18與疾病活動程度相關(guān)[9]。

圖2 腎小管損傷標志物診斷FSGS患者腎小管間質(zhì)急性病變的ROC曲線

FSGS以足細胞損傷和腎小管間質(zhì)病變?yōu)樘攸c,本研究進一步證實 FSGS較其他腎小球疾病腎小管間質(zhì)損傷更為明顯的原因獨立于蛋白尿嚴重程度之外。FSGS足細胞損傷源于循環(huán)中致病因子對足細胞的攻擊[10],而這些因子完全可以通過腎小球濾過作用于腎小管上皮細胞。我們的前期實驗亦已證實FSGS患者血清 IL-13水平增高;在此基礎(chǔ)上腎組織染色發(fā)現(xiàn) FSGS患者近端腎小管上皮細胞 IL-13受體的表達范圍和強度明顯增高,伴急性腎小管損傷者表現(xiàn)尤為突出[11],這些結(jié)果提示 FSGS中一些導致足細胞病變的因素,可能也同時攻擊了腎小管上皮細胞,參與腎小管間質(zhì)損傷的發(fā)生。另外,FSGS由于腎小球節(jié)段硬化尤其是血管極硬化性病變致出球小動脈狹窄,相應(yīng)腎單位缺血性損傷更為明顯。與此同時,FSGS常見腎小球毛細血管袢與包曼囊壁粘連,尿液反滲入腎間質(zhì),觸發(fā)間質(zhì)炎癥反應(yīng)[12,13],活化的細胞因子加重毛細血管內(nèi)皮細胞的損害,促進細胞外基質(zhì)的合成,該過程進一步減少甚至阻斷損傷區(qū)附近小管細胞的氧供。缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)均是加重小管間質(zhì)損傷的重要因素[14],上述原因可能導致同等蛋白尿情況下,FSGS患者腎小管功能指標較 MN、MCD患者明顯增高。

特發(fā)性 FSGS患者的尿 KIM-1、IL-18、NGAL與蛋白定量、腎功能、尿 NAG、RBP、CysC、C3、α2-MG等呈正相關(guān),能較好的反映腎臟損傷程度。同時我們還證實 FSGS患者尿 C3、α2-MG等反映腎小球濾過功能的指標較 MN、MCD患者亦顯著增高。C3、α2-MG的分子量分別為 185kD、720k D,是典型的大分子蛋白質(zhì),說明在腎小球疾病中蛋白尿的質(zhì)對腎小管間質(zhì)病變的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。同時,腎小管間質(zhì)病變又可通過球管反饋導致腎小球濾過功能受損,這也符合臨床上我們常見腎小管病變重者尿 C3、α2-MG等大分子尿蛋白通常陽性,腎小球病變也較重,激素治療多不敏感。

分析 FSGS各病理亞型的病情變化提示,頂部型小管損傷最輕,塌陷型最嚴重,但各組間 KIM-1、IL-18、NAGL水平未達統(tǒng)計學差異,有待擴大樣本量進一步證實。急性或慢性合并急性腎小管間質(zhì)病變患者與慢性腎小管間質(zhì)病變患者相比,尿 KIM-1、NGAL明顯增高,而血清白蛋白下降,提示 KIM-1、NGAL能較好的反映急性小管間質(zhì)損傷。21例NAG、RBP均在正常范圍內(nèi)的患者尿 KIM-1、IL-18、NGAL已出現(xiàn)增高,腎組織病理亦證實其中 62%患者存在不同程度的腎小管變性壞死?？梢?臨床上尿 RBP、NAG的升高可晚于形態(tài)學改變,對于無法完善腎活檢的患者,即使腎小管功能指標完全正常,也需警惕可能存在腎小管間質(zhì)病變。研究結(jié)果提示尿 KIM-1、NGAL、NAG是診斷腎小管間質(zhì)急性病變更為敏感特異的生物學標志物,而 IL-18、RBP、CysC因敏感性或特異性較差,無法成為理想的腎小管損傷標志物,無法在組織形態(tài)學改變之初早期診斷腎臟疾病。尿 KIM-1、NGAL、NAG作為腎小管上皮細胞在蛋白尿、缺血缺氧或代謝異常等影響下由細胞釋放或脫落的物質(zhì),早期即可出現(xiàn)異常[15,16],只有當腎小管功能失代償至一定程度引起小分子物質(zhì)的重吸收障礙時,尿 RBP、CysC的水平才會逐漸上升。

總之,本研究通過系統(tǒng)的觀察分析 FSGS患者功能和組織形態(tài)學的腎小管間質(zhì)損傷表現(xiàn),證實FSGS較 MN、MCD等其它腎小球疾病腎小管間質(zhì)損傷更為明顯,其原因獨立于蛋白尿嚴重程度之外,腎小球疾病中蛋白尿的質(zhì)在腎小管間質(zhì)病變中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。急性或慢性合并急性腎小管間質(zhì)病變患者與慢性腎小管間質(zhì)病變患者相比,尿 KIM-1、NGAL明顯增高。綜合得出,目前臨床上廣泛采用的眾多腎小管功能指標中,尿 KIM-1、NGAL、NAG能更好的反映急性腎小管間質(zhì)病變,為我們在臨床上早期、特異地發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變提供了依據(jù),盡早的干預和治療小管間質(zhì)損傷也是延緩腎臟病進展的重要環(huán)節(jié)之一。

1 湯天鳳,曾彩虹.腎臟疾病的篩查:傳統(tǒng)指標與新的生物學標記物.腎臟病與透析腎移植雜志,2009,18(2):161-166.

2 Kjeldsen L,Koch C,Arnljots K,et al.Characterization of two ELISAs for NGAL,anewlydescribed lipocalin in human neutrophils.JImmunological Methods,1996,198(2):155-164.

3 Wu I,Parikh CR.Screening for kidney diseases:older measuresversus novel biomarkers.Clin J Am Soc Nephrol,2008,3(6):1895-1901.

4 Han WK,Waikar SS,Johnson A,et al.Urinary biomarkers in the early diagnosis of acute kidney injury.Kidney Int,2008,73(7):863-869.

5 Schmidt-Ott KM,Mori K,Li JY,et al.Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin.JAm Soc Nephrol,2007,18:407-413.

6 Kuwabara T,Mori K,Mukoyama M,et al.Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin levels reflect damage to glomeruli,proximal tubules,and distal nephrons.Kidney Int,2009,75(3):285-294.

7 Melnikov VY,Ecder T,Fantuzzi G,et al.Impaired IL-18processing protectscaspase-1-deficient mice from ischemic acute renal failure.J Clin Invest,2001,107(9):1145-1152.

8 Li LS,Liu ZH.Epidemiologic data of renal diseases from a single unit in China:analysis based on 13,519 renal biopsies.Kidney Int,2004,66(3):920-923.

9 Kilis'-Pstrusińska K,Medyńska A,Zwolińska D,et al.Interleukin-18 in urine and serum of children with idiopathic nephrotic syndrome.Kidney Blood Press Res,2008,31(2):122-126.

10 劉志紅.微小病變性腎病及局灶節(jié)段性腎小球硬化.//黎磊石,劉志紅.中國腎臟病學.人民軍醫(yī)出版社,2008:P364-386.

11 鄭春霞,劉志紅,蘆怡舟,等.局灶節(jié)段性腎小球硬化患者腎小管上皮細胞白介素 13受體表達與組織損傷的關(guān)系.腎臟病與透析腎移植雜志,2009,18(1):20-26.

12 Kriz W,Elger M,Hosser H,et al.How does podocyte damage result in tubular damage?Kidney＆Blood Press Res,1999,22(1-2):26-36.

13 Meyrier A.Mechanisms of disease:focal segmental glomerulosclerosis.Nat Clin Pract Nephrol,2005,1(1):44-54.

14 Van Timmeren MM,Bakker SJ,Vaidya VS,et al.Tubular kidney injury molecule-1 in protein-overload nephropathy.Am J Physiol Renal Physiol,2006,291(2):F456-F464.

15 Mori K,Lee H T,Rapoport D,et al.Endocytic delivery of lipocalinsiderophore-iron complex rescurs the kidney from ischemia-reperfusion injury.J Clin Invest,2005,115(3):610-621.

16 Bazzi C,Petrini C,Rizza V,et al.A modern approach to selectivity of proteinuria and tubulointerstitial damage in nephrotic syndrome.Kidney Int,2000,58(4):1732-1741.