IL-21和IL-18對臍血來源的CIK細(xì)胞體外作用研究

楊新宇,肖佩玲,方亦兵,段華新,周 明

(湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院,中國 長沙 410005)

細(xì)胞因子殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)最初是外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子共同培育下獲得的一種異質(zhì)細(xì)胞．此種細(xì)胞增殖速度快，殺腫瘤活性強(qiáng)，殺瘤譜廣[1]．通過對CIK細(xì)胞表面標(biāo)志分析，研究者發(fā)現(xiàn)其主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+細(xì)胞，CD3+CD56+細(xì)胞主要來源于CD3+CD56-T細(xì)胞 ，并不是來源于單個(gè)核細(xì)胞中少量CD3+CD56+T細(xì)胞的擴(kuò)增[2]．臍血來源的CIK細(xì)胞比外周血來源的CIK細(xì)胞增殖速度更快，殺腫瘤活性更強(qiáng)[3]．同一條件下，如果在臍血來源的CIK中擴(kuò)增這種重要的抗腫瘤免疫前體細(xì)胞將具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值在．本實(shí)驗(yàn)中我們嘗試在傳統(tǒng)培養(yǎng)基礎(chǔ)上通過聯(lián)合IL-21和IL-18來擴(kuò)增CIK細(xì)胞，探討它們對CIK細(xì)胞誘導(dǎo)、擴(kuò)增的影響．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 .1 實(shí)驗(yàn)材料 IL-21和IL-18(Peprotech Ec公司，美國)；臍血(CB)來自我院產(chǎn)科正常足月分娩胎盤；K562細(xì)胞(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究所)；優(yōu)級胎牛血清和Ficoll人淋巴細(xì)胞離液(天津?yàn)柹镌噭┕?； 伽瑪干擾素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D公司，美國)；MTT試劑盒(上海晶美生物試劑公司)；抗CD3單抗(武漢生物制劑公司)，IL-2(江蘇金絲利藥業(yè)公司)和IFN-γ(上?？寺≡噭┕?，F(xiàn)ITC-CD3和PECY5-CD56(BECKMAN COULTER公司，美國)．

1.1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 胎兒臍血來自我院產(chǎn)科足月、順產(chǎn)、健康的胎兒胎盤臍帶．經(jīng)得家屬同意捐贈臍血，按衛(wèi)生部頒布的《獻(xiàn)血體檢標(biāo)準(zhǔn)》檢驗(yàn)合格，于第3產(chǎn)程自臍靜脈消毒后用200 mL采血袋全封閉采集臍血, 平均采量80～130 mL．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單個(gè)核細(xì)胞(CBMC)的分離和CIK細(xì)胞的培養(yǎng) 取臍血50 mL，PBS等體積稀釋，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(CBMC)．將CBMC加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)，加入IFN-γ(1 000 U/mL),在37 ℃、5%的CO2孵箱中孵育24 h后放入24孔板中(1×106/mL)．分4組，A組：IL-2+抗CD3單抗(對照組)； B組：IL-2+抗CD3單抗+IL-2l； C組：IL-2+抗CD3單抗+IL-18；D組：IL-2+抗CD3單抗+IL-21+IL-18．各因子劑量參照文獻(xiàn)報(bào)道，其中，IL-2：1 000 U/mL、抗CD3單抗：50 ng/mL、IL-2l：100 ng/mL、IL-18：100 ng/mL．每組復(fù)種三孔，重復(fù)5次；每3 d半量換液，同時(shí)全量補(bǔ)充上述細(xì)胞因子．

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)和增殖分析 分別在培養(yǎng)第3，6，9，12，14 d細(xì)胞換液時(shí)取每組各孔細(xì)胞臺盼藍(lán)染色后倒置顯微鏡下觀測各組細(xì)胞活性，同時(shí)用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)．

1.2.3 CIK細(xì)胞免疫表型的檢測 取1×106細(xì)胞放入96孔板中，加15 μL單抗(CD3/CD56)，同時(shí)設(shè)陰性對照孔，震蕩；室溫孵育30 min，加PBS洗2遍(1 000 r/min，5 min)，棄上清；再加約1 mL PBS，混勻，流式細(xì)胞儀檢測．

1.2.4 培養(yǎng)上清IFN-γ表達(dá)的檢測(酶聯(lián)免疫法) 在酶聯(lián)免疫板的各孔中分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔．標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入已稀釋好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品IFN-γ各50 μL，除空白孔外，待測樣品孔中每孔加待測樣品50 μL，37 ℃ 30 min后洗板5次，除空白孔外每孔再加入已稀釋好的酶標(biāo)試劑50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min．每孔加底物A、B各50 μL，避光，37 ℃ 10 min．每孔加終止液50 μL，混勻，即刻在450 nm處讀數(shù)．結(jié)果計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)．通過標(biāo)本的OD值計(jì)算出其濃度．

1.2.5 MTT顯色法測定三組臍血活化殺傷細(xì)胞的殺瘤活性 (1)調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞的濃度：收獲4組活化臍血?dú)?xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞即K562細(xì)胞，效靶比為20∶1．(2)實(shí)驗(yàn)組每孔加人效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞懸液各100 μL混勻，每組典加7孔：同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞對照，均設(shè)7孔，各取100 μL，在所有對照孔中各加入RPMI-1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)液100 μL， 37 ℃，5%CO2條件下共育24 h．(3)24 h后，離心后吸棄上清液100 μL，加入MTT儲液(5 mg/mL)10 μL，37 ℃，5%CO2條件下，再共育4 h．(4)吸棄上清液后加入Formanzan溶解液100 μL．37 ℃孵育4 h.(5)在酶標(biāo)儀上570 nm測定OD值．殺傷細(xì)胞毒活性%=[1-(試驗(yàn)孔OD值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞OD值)/單獨(dú)靶細(xì)胞OD值]×100%．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0軟件分析

所有實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示．?dāng)?shù)據(jù)分析使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件．多個(gè)樣本均數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)代表圖

見圖1：D組第14 d CIK細(xì)胞圖，可見大量細(xì)胞簇形成，胞體大小不一．

圖1 D組(IL-21+IL-18)細(xì)胞形態(tài)圖(×100)

2.2 細(xì)胞增殖分析

分析結(jié)果如表1.

表1 不同時(shí)期各組CIK細(xì)胞數(shù)

注:細(xì)胞培養(yǎng)第6 d時(shí)，(IL-21+1L-18)CIK組細(xì)胞數(shù)較對照組CIK組細(xì)胞數(shù)多，差異有顯著性(*P<0.05)；但較(IL-21 )CIK組和 (IL-18)CIK組細(xì)胞數(shù)無明顯差異(各P>0.05)；其余各天各組間細(xì)胞數(shù)無明顯差異(各P>0.05)．

2.3 CIK細(xì)胞表型檢測

第14 d應(yīng)用流式細(xì)胞儀對各組細(xì)胞進(jìn)行分析,見圖2.

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)第14 d加入IL-21的B組CIK細(xì)胞與A組比較CD3+CD56+細(xì)胞比由(35.4±5.5)%上升至(48.9±4.1)%；加入IL-18的C組CIK細(xì)胞與A組比較CD3+CD56+細(xì)胞比由(35.4±5.5)%上升至(48.4±5.5)%；同時(shí)加入IL-21和IL-18的D組CIK細(xì)胞與A組比較CD3+CD56+細(xì)胞比由(35.4±5.5)%上升至(57.9±3.7)%．結(jié)果如圖3.

2.4 酶聯(lián)免疫法測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度

如圖4，在培養(yǎng)第14 d，加入IL-21的B組CIK細(xì)胞上清IFN-γ濃度(ng/l)與A組比較由46.2±4.5上升至157.2±10.3；加入IL-18的C組CIK細(xì)胞上清IFN-γ濃度與A組比較由46.2±4.5上升至94.0±10.5；同時(shí)加入IL-21和IL-18的D組CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度與A組比較上升至167.6±13.9．

2.5 細(xì)胞殺傷力分析

各組細(xì)胞對K562細(xì)胞殺傷作用影響(圖5) 當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比為20∶1時(shí)，加入IL-21的B組CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷作用與A組比較由(33.9±4.4)%上升至(72.3±4.6)% ；加入IL-18的C組CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷作用與A組比較由(33.9±4.4)%上升至(55.8±6.5)% ；同時(shí)加入IL-21和IL-18的D組CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷作用與A組比較由(33.9±4.4)%上升至(78.5±3.6)% ．

A組(對照組)，CD3+CD56+%：34.74；B組(IL-21),CD3+CD56+%：45.37%圖2 各組CIK細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測代表圖

B組(IL-21)、C組(IL-18)和D組(IL-21+IL-18)均高于對照組(A組)(##P<0.01),D組均高于B組、C組(&P<0.05),B組與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別.圖3 培養(yǎng)第14 d各組CIK細(xì)胞的CD3+CD56+的百分比(N=4)

B組(IL-21)、C組(IL-18)和D組(IL-21+IL-18)培養(yǎng)液上清IFN-γ濃度均高于對照組(A組)(##P<0.01),D組均高于B組和C組(&P<0.05),且B組高于C組(*P<0.05).圖4 培養(yǎng)第14 d各組CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度(N=12)

B組(IL-21)、C組(IL-18)和D組(IL-21+IL-18)對K562細(xì)胞殺傷活性均高于對照組(A組)(##P<0.01)，D組均高于B組和C組(&P<0.05)，且B組高于C組(*P<0.01).圖5 培養(yǎng)第14 d各組CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞的溶瘤活性(N=7)

3 討論

CIK(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)細(xì)胞最初是人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)、伽瑪干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和抗CD3單克隆抗體(anti-CD3 monocolonal antibody，anti-CD3mAb)等誘導(dǎo)而成的具有殺傷多種腫瘤活性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞．IL-21和IL-18均是近年來發(fā)現(xiàn)的重要免疫調(diào)節(jié)因子，IL-21是IL-2家族成員，主要由CD4+T細(xì)胞分泌，在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞上均發(fā)現(xiàn)其受體，并且IL-21能促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖和功能[4-5]．IL-21通過對CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的促進(jìn)作用表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用[6]．IL-21單獨(dú)或在某些細(xì)胞因子的協(xié)同下通過Star3磷酸化途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞功能[5]．IL-18具有誘增IFN-γ、增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞毒作用，同時(shí)能促進(jìn)T細(xì)胞增值活化、增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用表現(xiàn)出積極的抗腫瘤活性，經(jīng)抗CD3分子單克隆抗體作用后的人T細(xì)胞在IL-18刺激下可以增殖，并對IL-18呈劑量依賴性[7-8]．IL-18刺激T細(xì)胞增殖是IL-2依賴性的，IL-18通過刺激Thl細(xì)胞分泌IL-2，由IL-2發(fā)揮間接促增殖效應(yīng)[9]．有學(xué)者曾聯(lián)合IL-21和IL-18對外周血T細(xì)胞、NK細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合IL-21和IL-18能活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞，并且兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度明顯增加[6]．由于IL-21和IL-18及其聯(lián)合對T細(xì)胞、NK細(xì)胞的特殊作用，我們首次嘗試?yán)肐L-21聯(lián)合IL-18培養(yǎng)CIK細(xì)胞，觀測其各項(xiàng)指標(biāo)的變化．

試驗(yàn)結(jié)果顯示在培養(yǎng)第6 d，IL-21聯(lián)合IL-18培養(yǎng)組CIK細(xì)胞總數(shù)最多，并與對照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別．提示D組CIK細(xì)胞擴(kuò)增啟動(dòng)時(shí)間較早．這一變化可能與兩種細(xì)胞因子的聯(lián)合有關(guān)[6]．但D組細(xì)胞數(shù)與其它各組間比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別．在培養(yǎng)第14 d，各組CIK細(xì)胞總數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別．有學(xué)者認(rèn)為IL-21促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖的作用是依賴TCR(T cells receptor，TCR)信號途徑，在缺少了TCR刺激活化信號后，它對T淋巴細(xì)胞增殖明顯減弱[10]．而抗CD3單抗是促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖的主要作用因子，其主要作用受體也是TCR．抗CD3單抗刺激增殖產(chǎn)生的CIK細(xì)胞，其表面TCR與原始成熟T細(xì)胞TCR結(jié)構(gòu)并不同，CIK細(xì)胞TCR結(jié)構(gòu)出現(xiàn)基因重排[11]， IL-21能否對這種TCR結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的T細(xì)胞TCR產(chǎn)生作用，目前尚未有報(bào)道．

四組CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞殺傷力比較，IL-21和IL-18均能顯著提高CIK細(xì)胞的溶瘤活性，其中IL-21聯(lián)合IL-18培養(yǎng)的CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞K562的溶瘤作用最強(qiáng)(優(yōu)于IL-21、IL-18單因子培養(yǎng)組)，其CD3+CD56+細(xì)胞比例亦最高．單因子組間比較，IL-21組的溶瘤活性要強(qiáng)于IL-18組，但兩組間CD3+CD56+比值無差別．單因子對CIK細(xì)胞的作用結(jié)果與國外報(bào)道IL-21單獨(dú)對NKT細(xì)胞的作用結(jié)果基本一致[12]．目前已經(jīng)證明IL-21的主要生物學(xué)作用是免疫平衡的調(diào)節(jié)．IL-21可抑制CD4+CD25+Treg的主要調(diào)節(jié)者轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(forkhead box P3， Foxp3)的表達(dá)，減少CD4+T細(xì)胞的分化形成Treg細(xì)胞(Regulatory T cells, Tregs)，從而相應(yīng)地抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，發(fā)揮介導(dǎo)免疫平衡和抗腫瘤作用[13]．腫瘤細(xì)胞不能在體內(nèi)徹底清除，一個(gè)很重要的原因就是腫瘤細(xì)胞高表達(dá)FasL，形成免疫逃逸．Fas-FasL途經(jīng)是CIK細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途經(jīng)之一[14]．但CIK細(xì)胞仍對部分高表達(dá)FasL的腫瘤細(xì)胞形成免疫逃逸，削弱了CIK細(xì)胞的溶瘤活性．CIK細(xì)胞的另一抗腫瘤途經(jīng)即通過細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1)直接殺傷腫瘤細(xì)胞．IL-18能增強(qiáng)Th1細(xì)胞上功能性Fasl的表達(dá)，有選擇的擴(kuò)增Fasl介導(dǎo)的Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[15]．

活化的CIK細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-a等對腫瘤細(xì)胞有直接抑制和間接作用．尤其IFN-γ可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)，提升CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，亦是CIK細(xì)胞發(fā)揮直接抗腫瘤、治療血液領(lǐng)域移植物抗宿主病的重要手段之一． IL-21促進(jìn)CIK細(xì)胞的IFN-γ的產(chǎn)生，主要也是與Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的平衡有關(guān)[16]． IL-18可通過IFN-γ的表達(dá)而促進(jìn)靶細(xì)胞對FasL途徑的敏感性，進(jìn)而促進(jìn)Fas-FasL途徑介導(dǎo)的NK細(xì)胞活性，間接殺傷腫瘤細(xì)胞[17]．這可能是IL-21 和IL-18誘導(dǎo)CIK細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-γ的原因之一．

綜上所述，IL-21聯(lián)合IL-18能顯著提高臍血來源CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，同時(shí)產(chǎn)生大量的IFN-γ．我們的試驗(yàn)研究將為進(jìn)一步提高CIK細(xì)胞過繼免疫治療效果提供試驗(yàn)依據(jù).

參考文獻(xiàn)：

[1] SCHMIDT-WOLF I G, NEGRIN R S, KIEM H P,etal. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induce killer cells with potent antitumor cell activity [J]. J Exped, 1991, 174(1):4 770-4 774.

[2] LU P H,NEGRIN R S. A novel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cell with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency[J]. J Immunol,1994,153:1 687-1 696.

[3] 王佳祥, 鄭 樹, 劉秋亮. 不同來源CIK細(xì)胞和殺傷活性的比較[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26(7):616-618.

[4] OSTIGUY V，ALLARD E L, MARQUIS M,etal. IL-21 promotes T lymphocyte survival by activating the phosphatidylinositol-3 kinase signaling cascade[J].J Leukoc Biol, 2007,823：645-656.

[5] TRENGELL M, MATIKAINEN S,SIREN J,etal.IL-21 in synergy with IL-15 or IL-18 enhances IFN-gamma production in human NK and Tcells[J].J Immunol, 2003, 170(11):5 464-5 469.

[6] MA H L, WHITTERS M J, KONZ R F，etal. IL-21 activates both innate and adaptive to generate potent antitumor responses that require perforin but are independent of IFN-gamma[J].J Immunol,2003，171(2):608-615.

[7] SUBLESKI J J，HALL V L，BACK T C，etal．Enhanced antitumor response by divergent modulation of natural killer and natural killer T cells in the liver[J]．Cancer Res，2006，66(22):11 005-11 012．

[8] YOKOYAMA A，MORI S，TAKAHASHI H K，etal．Effect of amodiaquine,a histamine N-Methyhransferase inhibitor, on, Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide-induced hepatitis in mice[J]．Eur J Pharmacol，2007,558(1-3):179-184.

[9] MICAUEF M J, OHTSULKI K, KOHNO F．Interfemn-gamnla-inducing factor enhances T helperl cytokine production by stimulated human T cell[J].Eur J Immunol, 1996, 26(7):1 647-1 651.

[10] KASAIAN M T, WHITTERS M J, CARTER L L,etal. IL-21 limits NK cell responses and promotes antigen-specific T cell activation: a mediator of the transition from innate to adaptive immunity[J].Immunity, 2002,16(4):559-569.

[11] GODFREY D I, STANKOVIC S, BAXTER A G. Raising the NKT cell family[J]. Nat Immunol, 2010, 11(3):197-206.

[12] BAXEVANIS C N, GRITZAPIS A D, PAPAMICHAIL M,etal. In Vivo Antitumor Activity of NKT Cells Activated by the Combination of IL-12 and IL-18[J]. The Journal of Immunology, 2003, 71(6):2 953-2 959

[13] MONTELEONE G, PALLONE F, MACDONALD T T,etal. Interleukin-21: a critical regu lator of the balance between effector and regulatory T-cell [J]. Cell responses, 2008, 29(6):290-294.

[14] VENLERIS M R, KOMACKER M, MAILANDER V,etal. Resistance of ex vivo expanded CD3+CD56+T cell to Fas-mediated apoptosis[J]. Cancer immunol immunothr, 2000, 49(6):335-345.

[15] TSUTSUI H, MATSUI K, KAWAD N. IL-18 accounts for both TNF-alpha and Fas ligand-mediated hepatotoxic pathways in endotoxin-induced liver injury in mice [J]. Im munol, 2007, 159 (8):3 961-3 967.

[16] MINAMI K, YANAGAWA Y, IWABUCHI K,etal. Negativefeedback regulation of T he lper type 1 (Th1)/Th2 cytokine balance via dendritic cell and natural killer T cell interactions[J]. Blood, 2005, 106(5):1 685-1 693.

[17] TANG Z H, QIU W H, WU G S,etal. The immunotherapeutic effect of dendritic cells vaccine modified with interleukin-18 gene and tumor cell lysate on mice with pancreatic carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(5):908-912.